[發(fā)明專利]基于FIX的抗原表位及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410273142.5
• 申請(qǐng)日: 2014-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105294857B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李榮秀;杜進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/745
• 分類號(hào): C07K14/745;C07K19/00;C07K16/36;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/13;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/00;A61K39/395;A61K47/42;A61K48/00;A61P7/02
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

本發(fā)明公開(kāi)了基于FIX的抗原表位及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種抗原表位肽，所述抗原表位肽源自動(dòng)物FIX且包含一個(gè)或多個(gè)抗原表位，并且所述抗原表位肽氨基酸序列長(zhǎng)度為FIX全長(zhǎng)的2?100％，且所述抗原表位肽的長(zhǎng)度為5?500個(gè)氨基酸；并且所述抗原表位肽與載體蛋白形成的重組蛋白可誘發(fā)同一種類的所述動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)FIX的免疫反應(yīng)。該抗原表位肽與載體蛋白融合后能激發(fā)起較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性針對(duì)FIX的抗體。本發(fā)明還公開(kāi)了一種特異性識(shí)別并結(jié)合人FIX的抗體及FIX抗體的制備方法，該抗體可用于人FIX的分離純化、檢測(cè)以及治療與所述抗原表位相關(guān)的疾病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種基于FIX的抗原表位及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

FIX是凝血系統(tǒng)中參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)重要的維生素K依賴的糖蛋白，它在人體內(nèi)的缺乏或不足將導(dǎo)致血友病B。終身輸注FIX制劑是血友病B最主要的治療途徑，也就是說(shuō)血友病B患者終身都離不開(kāi)FIX的治療，因此，獲得高安全性的hFIX對(duì)于血友病B病人來(lái)說(shuō)是非常重要的。

FIX的主要來(lái)源途徑是從健康人血漿中純化FIX(pdhFIX)和通過(guò)基因工程技術(shù)制備重組FIX(rhFIX)。傳統(tǒng)的pdhFIX純化方法包括磷酸鈣吸附法、氫氧化鋁吸附法、離子交換法和肝素親和純化法等。由于血液中hFIX的濃度非常低(健康人血漿中hFIX濃度約為5μg/mL)，且這類凝血蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)又十分相似，因此，這些傳統(tǒng)方法制備的hFIX純度總是很低，常含有FII、FVII、FX和蛋白C等，由于血友病人需要終生用藥，因此，反復(fù)注射這種低純度的hFIX制劑會(huì)有增加血栓形成和發(fā)生血栓栓塞的危險(xiǎn)。少數(shù)的一些方法雖然能夠制得純度較高的hFIX，但是由于其成本高或者回收率低，無(wú)法應(yīng)用于hFIX的工業(yè)化生產(chǎn)中。在rhFIX研制方面，已有通過(guò)牛乳系統(tǒng)成功表達(dá)出了有活性的rhFIX的報(bào)道，但是在其規(guī)模化分離純化方面，至今仍未能找到有效的方法。所嘗試的一些方法，包括離子交換層析、肝素親和層析或者幾種方法串聯(lián)使用等，均未能取得良好的結(jié)果，往往不是使得rhFIX失活就是因步驟繁多導(dǎo)致回收率極低或者純度過(guò)低。因此，研究出一種高效且適宜于的FIX(包括pdhFIX和rhFIX)規(guī)模化純化的方法便至關(guān)重要且迫在眉睫。

免疫親和層析因其高特異性和高純化效率被認(rèn)為是純化抗原的潛在理想方法，而它成功的關(guān)鍵首先在于是否能夠制得足量特異性好且親和力適中的抗hFIX抗體。1984年，Liebman等通過(guò)制備Ca²⁺依賴型的單克隆抗體來(lái)純化hFIX，結(jié)果，經(jīng)一步純化便獲得了特異凝血活性高達(dá)150IU/mg的純hFIX，回收率高，而且該單克隆抗體與hFIX的結(jié)親和力較為溫和，這樣便保證了hFIX的活性。但是，該單克隆抗體造價(jià)昂貴、制備周期很長(zhǎng)，限制了其在hFIX規(guī)模化生產(chǎn)中的應(yīng)用。多克隆抗體可被用于抗原的純化，而且制備簡(jiǎn)單，但是由于普通的多克隆抗體是由多個(gè)B表位產(chǎn)生的抗體混合物，性質(zhì)不均一，且親和力非常強(qiáng)，當(dāng)它用于純化時(shí)，洗脫條件難易掌握，且往往由于過(guò)于嚴(yán)苛的洗脫條件致使目標(biāo)蛋白失活。另一方面，多抗的特異性往往比較低，當(dāng)它用來(lái)純化牛乳中的rhFIX的時(shí)候，很可能會(huì)與牛內(nèi)源性FIX(bFIX)發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致純化的產(chǎn)物安全性降低，因此，它不適宜用來(lái)純化hFIX(包括pdhFIX和rhFIX)。因此，要解決這兩種抗體用于純化hFIX存在的問(wèn)題，就需要找到一種新的抗hFIX抗體制備方法，使其能夠產(chǎn)生足量特異性好且親和力溫和的抗體，從而使它能夠用于hFIX的規(guī)模化免疫親和純化，得到高純度且保持凝血活性的hFIX。

作為用于純化抗原的抗體，它識(shí)別的并不是整個(gè)抗原分子，而是抗原分子中的B表位。研究表明，抗體的特異性與抗原的特異性相關(guān)，而抗原的特異性實(shí)際上指的是表位的特異性。因此獲得特異性好、親和力適中的抗原表位是制備純化抗體的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于FIX的抗原表位肽及其應(yīng)用，該抗原表位肽與載體蛋白融合后能激發(fā)起較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性針對(duì)FIX的抗體。