[發明專利]一種聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子的制備方法及其藥物組合物

在審

• 申請號: 201410272925.1
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN105273076A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 陳慶財;文勇;鮑曼;張超;李文
• 申請（專利權）人: 江蘇奧賽康藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/535
• 分類號: C07K14/535;C07K1/107;C07K1/18;A61K38/19;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 北京慶峰財智知識產權代理事務所(普通合伙) 11417
• 代理人: 劉元霞;謝蓉

技術領域

本發明為生物醫藥領域，具體涉及一種聚乙二醇衍生化的重組人粒細胞刺激因子的制備方法及其包含該刺激因子的藥物組合物。

背景技術

粒細胞刺激因子(G-CSF)與造血細胞的表面受體結合從而刺激增生和阻止功能活化細胞增生。美國FDA于1991年批準重組人粒細胞刺激因子上市，商品名通用名非格司亭(Filgrastim)。Filgrastim是一種水溶性的蛋白，含有175個氨基酸，分子量約19千道爾頓，由E.coli發酵獲得。Filgrastim的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

G-CSF的聚乙二醇衍生化可以降低血漿清除率，延長半衰期。美國FDA于2002年批準了聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)上市，商品名用于非髓性惡性腫瘤患者在接受會發生有臨床意義發熱性中性粒細胞減少的抑制骨髓的抗腫瘤藥治療時，降低因發熱性中性粒細胞減少而引起的感染發生率。是Filgrastim與單甲氧基聚乙二醇的共價綴合物，由FilgrastimN端甲硫氨酸的氨基與單甲氧基聚乙二醇共價結合。單甲氧基聚乙二醇的分子量約為20千道爾頓，的平均分子量約為39千道爾頓。

現有技術中已知的制備PEG-rhG-CSF的方法操作步驟復雜，成本高，不利于工業化生產，例如，CN1824324A中公開的制備PEG-rhG-CSF的方法，在制備開始時需要更換緩沖液，在制備過程中需要加入額外的試劑DMMAn(二甲基馬來酸酸酐)，并且反應溫度達到了37℃；CN101711876A中公開的制備PEG-rhG-CSF的方法，需要在反應結束時加入大量的甘氨酸終止反應，并且在純化過程中需要使用S-200、DEAE和CM柱等三種層析柱，增加了工業化的成本；CN102485742A中公開的制備PEG-rhG-CSF的方法，在制備開始時使用磷酸鹽緩沖液液，在反應結束時加入胱氨酸終止反應，并且在純化過程中需要使用梯度洗脫。

發明內容

本發明提供了一種聚乙二醇衍生化的重組人粒細胞刺激因子的制備方法及其藥物組合物。

本發明通過如下技術方案實現：

一種制備聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)通過堿調節劑調節含有重組人粒細胞刺激因子(rhG-CSF)的母液pH至第一pH；

(b)母液中加入甲氧基-聚乙二醇-丙醛(mPEG-PAL)，攪拌溶解；

(c)加入NaBH₃CN，攪拌反應；

(d)通過酸調節劑調節反應液pH至第二pH終止反應，得聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子；

所述聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子為重組人粒細胞刺激因子N端與聚乙二醇以1:1共價結合。

所述堿調節劑優選地為無機堿或其溶液；更優選地為NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃，或其溶液；進一步優選地為NaOH、Na₂CO₃或其溶液；最優選地為NaOH或其溶液。堿調節劑最優選地為NaOH或其溶液是為了減少在反應體系中引入其他物質，更大程度地提高產品質量，選擇其他調節劑并不影響發明技術方案的實現。

所述酸調節劑優選地為無機酸或有機酸或其溶液；更優選地為鹽酸、硫酸、硝酸、磺酸等或其溶液；進一步優選地為鹽酸溶液、醋酸、醋酸溶液；最優選地為鹽酸溶液。酸調節劑最優選地為鹽酸溶液是為了減少在反應體系中引入其他物質，更大程度地提高產品質量，選擇其他調節劑并不影響發明技術方案的實現。

優選地所述第一pH為5～7；優選地所述第二pH為3～4。

優選地所述甲氧基-聚乙二醇-丙醛的分子量為8千道爾頓～22千道爾頓；更優選地為19千道爾頓～21千道爾頓。

所述含有重組人粒細胞刺激因子的母液中含有18～22mmol/LNaAc和45～55mmol/LNaCl。優選地NaAc濃度為約20mmol/L。優選地NaCl濃度為約50mmol/L。優選地母液中重組人粒細胞刺激因子的濃度為0.5～2.5g/L，更優選地為0.5～1.5g/L，進一步優選為約1g/L。