[發明專利]一種梨果皮光滑度主效QTL位點的SNP分子標記引物及其應用

有效

• 申請號: 201410272786.2
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104032018A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 吳俊;張紹鈴;李雷廷;孫江妹;張全軍;劉倫;齊開杰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種與梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth緊密連鎖的SNP標記Pybd02_010引物對，其特征在于：正向引物SMOOTH-F：SEQ?ID?NO.1，反向引物SMOOTH-R：SEQ?ID?NO.2。

2.權利要求1所述的SNP標記引物對在梨分子育種中的應用，其特征在于利用所述的引物對基于高分辨率溶解曲線鑒定檢測登錄號為AJSU00000000的梨基因組序列scaffold283.0的第416246個堿基處是否存在一個與梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth，同時檢測QTL位點qSmooth上的多態性表達果皮光滑度的差異，預測梨果皮光滑度，以實現梨果皮光滑度性狀的早期鑒定和篩選。

3.權利要求1所述的SNP標記引物對在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth及其SNP多態性中的應用。

4.權利要求1所述的引物用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth的SNP標記方法，其特征在于：利用權利要求1所述的SNP標記引物對梨基因組DNA進行HRM反應，如果擴增產物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth；PCR循環結束后進行熔解，最后，在480II的Gene?Scanning軟件中1.5version自動生成擴增產物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth上表達果皮光滑的品種和表達果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點qSmooth上的多態性表達果皮光滑度的差異，如果未知品種得到的擴增產物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth上的多態性表達的果皮光滑度和對照相似。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的已知梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth上表達果皮粗糙的品種為‘碭山酥梨’，已知梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth上表達果皮光滑的品種為‘八月紅’。

6.根據權利要求5所述的SNP標記方法，其特征在于所述的HRM反應的反應體系按照480High?Resolution?Melting?Master試劑盒中的說明書進行，HRM分析是在480II熒光定量PCR儀上進行；10μL反應體系：含有2ng·μL^-1梨基因組DNA模板、1×Master?Mix、2.0mmol·L^-1MgCl₂、0.2mmol·L^-1權利要求1所述的引物對；擴增程序采用降落式PCR：95℃預變性10min，然后95℃變性10s、60～55℃，每循環下降0.5℃，退火15s、72℃延伸12s的程序進行45個循環；

PCR循環結束后進行熔解的程序為：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再從65℃連續升溫至95℃，每升高0.04℃，收集熒光1次，最后降溫至40℃。

7.一種與梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth緊密連鎖的SNP標記Pybd02_010，其特征在于該分子標記由引物對：正向引物SMOOTH-F：SEQ?ID?NO.1和反向引物SMOOTH-R：SEQ?ID?NO.2擴增梨基因組DNA得到。

8.權利要求7所述的SNP標記Pybd02_010在梨分子育種中的應用，其特征在于該分子標記位于梨的第2連鎖群的76.3cM處，Kruskal-Wallis統計測驗值為15.118，在α＝0.001顯著水平下顯著，利用區間作圖法的LOD值為2.72，解釋14.1％的遺傳變異。

9.權利要求7所述的SNP標記在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth及其SNP多態性中的應用。

10.權利要求7所述的SNP標記用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth的SNP標記方法，其特征在于：利用權利要求1所述的SNP標記引物對梨基因組DNA進行HRM反應，如果擴增產物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth；PCR循環結束后進行熔解，最后，在480II的Gene?Scanning軟件中1.5version自動生成擴增產物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth上表達果皮光滑的品種和表達果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點qSmooth上的多態性表達果皮光滑度的差異，如果未知品種得到的擴增產物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點qSmooth上的多態性表達的果皮光滑度和對照相似；其中所述的已知具有與梨果皮光滑度相關的QTL位點qSmooth上表達果皮粗糙的品種為‘碭山酥梨’，表達果皮光滑的品種為‘八月紅’。