[發明專利]一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法

無效

• 申請號: 201410271485.8
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104004668A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 楊金奎;蘇浩;趙勇;張克勤
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N3/00;A01P5/00;C12R1/645
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域:

本發明涉及一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，屬于應用微生物學領域。

背景技術:

植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生線蟲所引起的農作物經濟損失高達1570億美元(Abad?et?al.,2008)。在我國，線蟲危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麥、水稻、林木和中藥材等幾乎所有的經濟作物，成為農業生產中重要的限制因子之一。目前對植物線蟲病害的防治仍然以化學防治為主，但由于化學農藥對生態環境的影響以及寄生線蟲抗藥性的增加，使其應用逐步受到限制，因此采用線蟲天敵進行生物防治日益受到研究人員的關注(劉杏忠等,2004；楊曉野等,2004；Moosavi?and?Zare,2012)。

捕食線蟲真菌(Nematode-trapping?fungi)是線蟲的重要天敵之一，對于自然界中線蟲種群數量的控制具有重要的調節作用。捕食線蟲真菌根據形態學特征分為節叢孢屬(Arthrobotrys?spp.)、單頂孢屬(Monacrosporium?spp.)和隔指孢屬(Dactylella?spp.)(張克勤等,2006)。這一類特殊類群真菌的營養菌絲能夠特化形成粘性菌網、粘球和收縮環等捕食器官，完成對植物寄生線蟲的捕捉和侵染過程(張克勤等,2006；Yang?et?al.,2012)。因此，捕食線蟲真菌是開發高效線蟲生防制劑的重要資源(Nordbring-Hertz,2004；Moosavi?and?Zare,2012)。捕食器官是真菌捕捉和侵染線蟲的重要武器，捕食器官形成的數量與真菌的捕食效率密切相關。目前，部分捕食線蟲真菌已經被開發成為生防制劑用于植物寄生線蟲的生物防治(劉杏忠等,2004)，但是由于土壤抑菌作用等抑制了真菌孢子的萌發和捕食器官的形成，現有的線蟲生防制劑存在防效不高和防效不穩的現象，嚴重的限制了線蟲生防制劑的推廣和應用。因此，闡明捕食器官形成的分子機制對于高效生防制劑的開發具有十分重要的意義。

捕食器官的形成是捕食線蟲真菌侵染線蟲的必要條件之一，在實驗室培養條件下，大多數捕食線蟲真菌的捕食器官能通過線蟲誘導產生，同時也能通過線蟲提取液、線蟲激素和小肽等誘導產生(Yang?et?al.,2011；Hsueh?et?al.,2013)。盡管前期有人報道氨基酸能夠誘導捕食線蟲真菌寡孢節叢孢(Arthrobotrys?oligospora)產生捕食器官(Friman?et?al.,1985；王瑞等,2008)，但他們主要是通過在培養基中添加氨基酸進行誘導，每個平板中捕食器官形成的數量不到350個，而本發明的方法是利用合適濃度的氨基酸溶液浸泡捕食線蟲真菌的孢子，并把孢子涂布于水瓊脂平板，每個平板產生的捕食器官數量最多能夠達到1600個以上。

經文獻檢索，未發現與本發明內容相同文獻的公開報道。

發明內容：

本發明的目的是克服現有技術之不足，而提供一種利用氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官的方法，迅速獲得大量的捕食器官，為進一步研究捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料，同時也為高效線蟲生防制劑的開發奠定基礎。

本發明涉及的氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和谷氨酸)為實驗室常規實驗用品，能從國內外市場購買得到。本發明涉及的捕食線蟲真菌，如寡孢節叢孢(Arthrobotrys?oligospora)和環捕節叢孢(Arthrobotrys?brochopaga)為常規實驗用真菌，能從國內外的微生物保藏機構購買得到。

本發明在常規方法基礎上改進而成。本發明實現的步驟如下：

1.氨基酸溶液的配制

1)實驗用品：滅菌去離子水、滅菌三角瓶、燒杯、0.22μm的濾膜、無菌醫用注射器、及磁力攪拌器。

2)配制方法：準確稱取0.5g氨基酸(纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸)，放入燒杯中；用量筒準確量取100mL滅菌去離子水，倒入上述燒杯中，磁力攪拌使氨基酸充分溶解；用0.22μm的無菌濾膜對上述氨基酸溶液進行過濾除菌，濾液裝入事先滅菌的三角瓶中，于4℃冰箱中保存備用；用時稀釋得到不同終濃度(0.005，0.05和0.1g/L)的氨基酸溶液。

2.誘導培養基的配制

水瓊脂培養基：用于氨基酸誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官。每1000mL去離子水,加入20g瓊脂，121℃滅菌20分鐘。

3.捕食線蟲真菌的培養(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節叢孢A.oligospora為例)

1)培養基：PDA培養基和CMA培養基的組成和配制方法如下：