[發(fā)明專利]一株嗜酸性氧化硫硫桿菌抗銅基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410271443.4
• 申請(qǐng)日: 2014-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN104017766A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉相梅;文晴;林建群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C22B3/18;C12R1/01
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一株穩(wěn)定遺傳的嗜酸性氧化硫硫桿菌抗銅基因工程菌，其特征在于：所述菌株命名為嗜酸性氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus?thiooxidans)copB_Af，該菌株已于2014年06月09日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC?No.9286。

2.權(quán)利要求1所述穩(wěn)定遺傳的嗜酸性氧化硫硫桿菌抗銅基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟是：

(1)從嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus?ferrooxidans)ATCC23270基因組上PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子的銅離子外排P型ATPase基因copB_Af，構(gòu)建到嗜酸性氧化硫硫桿菌整合型質(zhì)粒pZK19-IngUH-IngDH上獲得重組質(zhì)粒pZK19-copB_Af，利用轉(zhuǎn)化方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichia?coli)S17-1λpir中；

(2)以野生型A.thiooxidans?ATCC19377菌株作為受體菌，含重組質(zhì)粒pZK19-copB_Af的大腸桿菌E.coli?S17-1λpir作為供體菌，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將含有copB_Af基因的整合型質(zhì)粒pZK19-copB_Af轉(zhuǎn)入嗜酸性氧化硫硫桿菌菌株ATCC19377中；將接合菌液稀釋后涂布到含150μg/mL卡那霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固體平板上，30℃培養(yǎng)10天長(zhǎng)出單菌落；將1.0μL12mg/mL的無菌X-gal溶液滴加單菌落上，生成的藍(lán)色單菌落即是篩選獲得的copB_Af基因整合的A.thiooxidans單交換菌株，通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證確認(rèn)；

(3)以copB_Af基因整合的A.thiooxidans單交換菌株作為受體菌，含pMSD1-PTSceI質(zhì)粒的E.coli?SM10作為供體菌，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將誘導(dǎo)質(zhì)粒pMSD1-PTSceI轉(zhuǎn)入copB_Af基因整合的A.thiooxidans單交換菌株中；將接合菌液稀釋后涂布到含12mg/mL?X-gal溶液和150μg/mL鏈霉素的Starkey-Na₂S₂O₃固體平板上，30℃培養(yǎng)10天獲得發(fā)生第二次同源重組的白色單菌落；挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR篩選獲得A.thiooxidans?copB_Af基因整合的基因工程菌，該菌株命名為嗜酸性氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus?thiooxidans)copB_Af。

3.權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定遺傳的嗜酸性氧化硫硫桿菌抗銅基因工程菌在生物浸礦中的應(yīng)用。