[發(fā)明專利]一種茄鐮刀菌漆酶及其克隆和重組表達(dá)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410271201.5
• 申請(qǐng)日: 2014-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN104073475A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙辛;吳兆韡;司瑋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/10;C12N15/81;C12R1/77;C12R1/84
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的從茄鐮刀菌上克隆的茄鐮刀菌漆酶的基因序列和表達(dá)蛋白，屬于生物工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

在造紙，紙漿，漂白以及飼料生產(chǎn)中，為了降低化學(xué)品導(dǎo)致的污染，生物酶制劑的應(yīng)用越來越廣泛，在這之中漆酶的使用非常普遍，漆酶是一種結(jié)合多個(gè)銅原子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶。漆酶作用底物相當(dāng)廣泛，能夠?qū)Χ喾N污染物如各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚、芳香胺等。漆酶是近年發(fā)現(xiàn)在造紙工業(yè)中最具潛力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解，不會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，并且生產(chǎn)在常溫、常壓的溫和條件下進(jìn)行，節(jié)約設(shè)備和能耗。因此漆酶在造紙工業(yè)廢水處理等方面有著非常巨大的應(yīng)用前景，但是已有的漆酶普遍存在比活力低，耐熱性，堿耐受性差等問題。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，申請(qǐng)人多年來嘗試篩選從菌株中尋找不同的蛋白酶以期獲得良好的降解木質(zhì)素的能力，在大量篩選中申請(qǐng)人從一種茄鐮刀菌(Fusarium?solani?strain)中克隆其核苷酸序列進(jìn)行了克隆得到了一個(gè)完整的漆酶基因序列，基于該序列表達(dá)的漆酶具有高比活力，強(qiáng)的熱耐受性，堿耐受性等特點(diǎn)。?

基于上述發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)人完成了本發(fā)明。本發(fā)明的技術(shù)方案是如下實(shí)現(xiàn)的：?

本發(fā)明首先公開了一種茄鐮刀菌漆酶，其相關(guān)蛋白基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示。?

上述茄鐮刀菌漆酶既可以通過人工合成相關(guān)基因序列得到(例如華大基因或其它生物基因合成單位均提供相關(guān)商業(yè)服務(wù))，也可以通過克隆茄鐮刀菌來獲得，該漆酶基因的克隆方法具體包括下述步驟：?

1)以木質(zhì)素為唯一碳源培養(yǎng)茄鐮刀菌菌株，然后回收菌體，提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；?

2)對(duì)所得cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到茄鐮刀菌菌株的漆酶基因部分序列進(jìn)行測(cè)序。?

在上述克隆方法中，所采用的克隆引物對(duì)如下所示：?

Lac-F1CAAGGGAACGACCATGCAYTDBCAYGG；?

Fus-R1CCACTTCGAAGTGCCAATCTANRTGRCARTGdIA。?

在上述引物序列中，Y、R、B、D等代表兼并堿基，其所對(duì)應(yīng)的可替換堿基序列采用本領(lǐng)域通用規(guī)則，即R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T,N＝A/C/G/T；其中的dI代表脫氧次黃嘌呤，從其功能上而言相當(dāng)于N，擴(kuò)增效果更好。?

克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)的新漆酶基因使用5’RACE與3’RACE得到其完整mRNA序列，該漆酶命名為lcc4。?

最后，申請(qǐng)人深入研究了上述漆酶的重組表達(dá)方法，發(fā)現(xiàn)采用畢赤酵母作為載體具有較為理想的表達(dá)效力，具體的包括下述步驟:?

1)使用Eco?RI、Not?I限制兩端帶有酶切位點(diǎn)的鐮刀菌漆酶基因以及pPIC9K，膠回收產(chǎn)物，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.coli?Top10，鑒定轉(zhuǎn)化子，取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；?

2)將質(zhì)粒DNA(克隆至pPIC9K的重組子)，用Sac?I線性化質(zhì)粒，沉淀并回收DNA；?

3)取畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞和線性化的質(zhì)粒DNA混合均勻后電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化器完成后加入預(yù)冷的山梨醇溶液，將液體涂布MD平板，培養(yǎng)至白色的菌落長(zhǎng)出；?

4)影印轉(zhuǎn)化子至含有抗生素的YEPD平板培養(yǎng)，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落到普通YEPD平板上培養(yǎng)將其接種至BMGY液體培養(yǎng)基；5)培養(yǎng)后離心收集菌體，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液放入另一無菌搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)并加入甲醇維持誘導(dǎo)。?

在上述誘導(dǎo)完成后，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)即可。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明漆酶在畢赤酵母中的重組表達(dá)過程示意圖。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1?

茄鐮刀菌Fusarium?solani?strain，以木質(zhì)素為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，28℃震蕩培養(yǎng)5天然后回收菌體，提取其總RNA，使用oligo(dT)18反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，?使用說明書公開的引物擴(kuò)增(常規(guī)PCR條件即可)得到漆酶基因部分序列測(cè)序，隨后使用，5’RACE與3’RACE得到了漆酶基因的完整mRNA序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析與比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)漆酶基因尚未被公開過，命名為lcc4。?