[發明專利]高GC含量大片段DNA的體外組裝方法及應用

有效

• 申請號: 201410270968.6
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN105200035B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 姜衛紅;李雷;蘆銀華;戈梅;楊晟
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院;上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;崔佳佳

1.一種靶核酸序列的體外組裝方法，其特征在于，包括步驟：

(a)提供用于拼接的n個結構單元，各結構單元的序列記為L_n，其中所述的n為2-6的正整數；和線性化的載體元件；

其中，

(i)所述的n個所述結構單元可拼接成式I所示結構的、兩端分別帶有第一和第二重疊區以及第一和第二限制性內切酶酶切位點的第一級拼接序列：

L1-L2-L3-…-Ln (I)

式中，

L1、L2、……、Ln為各結構單元的核苷酸序列；

并且，位于第一級拼接序列的5'端的L1具有從5'至3'方向的式II所示的結構：

X0-X1-X2-X3-L1' (II)

式中，

X0為無或任意的長度為1-100bp核苷酸序列；

X1為第一重疊區；

X2為第一限制性內切酶酶切位點，并且所述的第一限制性內切酶選自下組：NheI、NdeI；

X3為無或任意的長度為1-20bp核苷酸序列；

L1'為待保留的拼接單元序列；

其中，X0-X1-X2-X3構成位于5'端的第一側翼序列；

并且，位于第一級拼接序列的3'端的Ln具有從5'至3'方向的式III所示的結構：

Ln'-X4-X5-X6-X7 (III)

式中，

X7為無或任意的長度為1-100bp核苷酸序列；

X6為第二重疊區；

X5為第二限制性內切酶酶切位點，所述的第二限制性內切酶選自下組：NheI、NdeI；并且所述的第一限制性內切酶和第二限制性內切酶是不同的酶；

X4為無或任意的長度為1-20bp核苷酸序列；

Ln'為待保留的拼接單元序列；

其中，X4-X5-X6-X7構成位于3'端的第二側翼序列；

并且，第一重疊區和第二重疊區是互不相同的，且GC含量為0-50%；

(ii) 所述線性化的載體元件的結構如式IV所示，

X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b (IV)

式中，

X0b為X0的互補序列；

X1b為X1的互補序列，即第一重疊區的互補序列；

X2b為所述的第二限制性內切酶酶切位點；

X3b為X3的互補序列；

Z為載體的結構序列；

X4b為X4的互補序列；

X5b為所述第一限制性內切酶酶切位點；

X6b為X6的互補序列，即第二重疊區的互補序列；

X7b為X7的互補序列；

(b) 在外切酶、聚合酶和/或連接酶酶存在下，使上述的n個結構單元和線性化的載體元件進行組裝，從而形成式V所述的第一級連接產物，其中所述連接產物為環狀；

(V)

式中，L1、L2、L3、Ln、X0b、X1b、X2b、X3b、Z、X4b、X5b、X6b、X7b的定義如上所述；

(c) 用所述的第一限制性內切酶和/或第二限制性內切酶對上一步驟的連接產物進行酶切，從而獲得用于下一級組裝的結構單元；并且重復步驟(a)和步驟(b)共j次，從而形成第j+1級連接產物，其中j為1-5的正整數，并且所述的靶核酸序列的CG含量≥65%，所述的第一重疊區的CG含量為0-50%，所述的第二重疊區的CG含量為0-50%。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，X0、X3、X4、和X7中的一個或多個為無。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，X0b、X3b、X4b、和X7b中的一個或多個為無。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一側翼序列中的X1為SEQ ID NO.:1和/或所述的第二側翼序列中的X6為SEQ ID NO.: 2。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的兩個相鄰的結構單元之間設有長度為10-50bp的粘性末端。