[發(fā)明專(zhuān)利]一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410270513.4
• 申請(qǐng)日: 2014-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104087573A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方長(zhǎng)旬;林文雄;李程勛;李穎哲;林威鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

水培種植法作為無(wú)土栽培的重要形式，具有節(jié)肥、節(jié)水、省工、省藥、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、潔凈等優(yōu)點(diǎn)。由于其不受時(shí)間限制，可供植物利用的營(yíng)養(yǎng)充分、均勻等優(yōu)點(diǎn)，因而在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)設(shè)施生產(chǎn)過(guò)程中逐漸被大范圍采用。在這些水培種植系統(tǒng)中，微生物也廣泛存在于水培液中，這些微生物能夠?qū)θ芤褐械牡V質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素以及植物根系釋放的次生物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在植物與礦質(zhì)養(yǎng)分之間起到了重要的媒介作用，因而是水培種植條件下，植物能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。因此，研究水培液中微生物的結(jié)構(gòu)組成與數(shù)量分布，能夠?yàn)閮?yōu)化植物的最佳水培種植條件提供重要基礎(chǔ)。然而，由于傳統(tǒng)的微生物研究方法存在著無(wú)法獲得環(huán)境中全部微生物的限制因素，由此導(dǎo)致對(duì)相應(yīng)環(huán)境中微生物遺傳背景信息的了解也不全面，從而也限制了水體微生物宏基因組信息的深入發(fā)掘。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)，以及基于PCR的末端限制性長(zhǎng)度態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)、單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)技術(shù)，長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)則克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所造成的土壤微生物信息大量丟失的弊端，更加全面、精確地揭示出水體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。

對(duì)于此，如何簡(jiǎn)便快捷地從水培液中獲得微生物的DNA是深入研究水培液中微生物組成的關(guān)鍵，由于水培液的相對(duì)體積大，微生物分布分散，直接提取往往會(huì)因?yàn)闃悠烦跏俭w積、微生物數(shù)量低而導(dǎo)致提取效率低下，因此需要研制適用于水體微生物DNA提取的方便、快捷、實(shí)用的方法，解決使用常規(guī)方法所獲得的微生物總量少、細(xì)胞裂解率低、DNA產(chǎn)量低的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，利用該方法提取的核酸純度較高，且產(chǎn)量較高。

一種水培液微生物基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

(1)水體樣品雜質(zhì)的去除：取100~250ml的水培液用定性濾紙過(guò)濾3~5次，并收集濾液；進(jìn)一步用孔徑為0.22μm的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置于10ml的離心管中；

(2)水體微生物細(xì)胞裂解：往步驟（1）10ml的離心管中加入500μl無(wú)菌水，漩渦震蕩，然后在液氮2~3?min和65℃水浴5min中反復(fù)凍融3~5次，凍融結(jié)束后，于4℃?13000rpm下離心?10min，棄上清，收集沉淀，加入100μl?1×TE，重懸沉淀，加入30μl?50mg/ml的溶菌酶，37℃溫浴1~3h，再加入500μl?的10%?SDS，以及10ul?20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1~2h；

(3)核酸游離及沉淀：步驟（2）溫浴結(jié)束后加入200μl?5M的NaCl，加入100μl?65℃預(yù)熱的3×CTAB/NaCl，65℃溫浴1h，待冷卻后，加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體積比為（1:1），4℃?11000rpm?離心10min，取上清，再加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體積比為（1:1），4℃?11000rpm?離心10min，將上清移至新管并加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置1h，然后4℃?11000rpm?離心?20min，棄上清，沉淀用70%乙醇重懸并于4℃?11000rpm?下離心?10min，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于30~50ul的無(wú)菌水中，-80℃保存。

所述水培液微生物基因組DNA的提取方法，優(yōu)選的步驟如下：

(1)水體樣品雜質(zhì)的去除：取100ml的水溶液用定性濾紙重復(fù)過(guò)濾3次，以去除水體中含有的雜質(zhì)，并收集濾液；進(jìn)一步用孔徑為0.22μm的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置于10ml的離心管中。

水體微生物細(xì)胞裂解：往離心管中加入500μl無(wú)菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min后置于65℃水浴鍋中溫浴5min，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后，樣品于4℃?13000rpm下離心?10min，棄上清，收集沉淀。加入100μl?1×TE，重懸沉淀。加入30μl?50mg/ml的溶菌酶，37℃溫浴1h。加入500μl?的10%?SDS，以及10ul?20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1h。