[發(fā)明專利]一種特異性識別克諾羅桿菌的單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410269714.2
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN104017074B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊捷琳;吳建祥;黃應(yīng)峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;G01N33/577;C12N5/20;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種特異性識別克諾羅桿菌的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

克諾羅桿菌(原稱阪崎腸桿菌)是嬰幼兒乳制品中的重要致病菌，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和茵血癥，造成嚴重的后遺癥和死亡，死亡率高達50％以上，成人感染則癥狀輕微。目前尚不清楚克諾羅桿菌的污染來源，許多病例報告表明嬰兒配方粉是目前發(fā)現(xiàn)的主要感染渠道。

克諾羅桿菌是一種屬革蘭氏陰性、不會形成孢子而呈棒狀的細菌，屬腸桿菌科，最適宜在37至43℃之間生長。除了奶粉外，克諾羅桿菌還被從不同環(huán)境和食物中分離出來，如水、溫泉、水稻種子、啤酒杯、咸肉等等。

因此，準確地鑒定克諾羅桿菌對于食品檢測業(yè)而言是很重要的。現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)開發(fā)了一些針對克諾羅桿菌的抗體，并建立了一些檢測方法，包括常規(guī)生化鑒定、PCR測定、血清學(xué)檢測方法等。

目前檢測克諾羅桿菌的方法主要通過常規(guī)生化鑒定和PCR測定其16S RNA。這些檢測方法耗時較長，對檢驗員的要求較高，假陰性較高。PCR法檢測則費用昂貴，對儀器設(shè)備及檢測環(huán)境的要求很高。血清學(xué)檢測成本低廉，易于操作；但血清學(xué)檢測的缺點是易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不適合作為獨立的檢測方法應(yīng)用。

并且，克諾羅桿菌有很多的種或亞種)，現(xiàn)有的檢測抗體(多為多克隆抗體)往往難以準確地對多種種或亞種)發(fā)揮識別作用。

綜上，本領(lǐng)域迫切需要找到能夠特異性識別克諾羅桿菌多種亞型或亞種，但與克諾羅桿菌以外的其它菌株沒有交叉反應(yīng)的特異性檢測抗體。以用于進一步開發(fā)克諾羅桿菌的快速、準確、靈敏的檢測方法，控制食源性致病菌感染，以及用于研究克諾羅桿菌流行病學(xué)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性識別克諾羅桿菌的單克隆抗體及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種單克隆抗體，其是由保藏號為CGMCC NO.7808的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測克諾羅桿菌的檢測試劑盒。

在一個優(yōu)選例中，所述的克諾羅桿菌包括：ATCC 29544、DSM 18702、DSM18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707、ATCC51329、CGMCC10403-22、CGMCC10403-23、NCTC9529、CGMCC 10419、CGMCC 10439、CGMCC 10456、CGMCC 10457、CGMCC 10462、CGMCC 10468、CGMCC 10473、CGMCC 10483、CGMCC 30417、CGMCC 30418。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測克諾羅桿菌包括：(1)定性檢測克諾羅桿菌；或(2)定量檢測克諾羅桿菌。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種雜交瘤細胞株，其在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號是CGMCC NO.7808。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測克諾羅桿菌的測試條(如試紙或試紙條)，其包括固相載體，以及附著于所述固相載體上的所述的單克隆抗體。

在一個優(yōu)選例中，所述的測試條是免疫膠體金測試條。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備包含所述的單克隆抗體的免疫膠體金測試條的方法，所述方法包括：所述的單克隆抗體以1～4mg/mL(如2mg/ml)的包被濃度，點到硝酸纖維素膜上，羊抗鼠二抗以0.8-1.2mg/ml作為Control線點到硝酸纖維素膜上；干燥；將單抗標記為標記量10-11μg、OD值23-27的金標溶液，選擇噴量為2.5-3.5μL/cm點到聚酯膜上干燥的金標條，組合上pH3-4樣品墊制成試劑條；采用pH7.4含1.5％非離子型聚氧乙烯(20)油醇的0.05M PBST緩沖液作為樣品緩沖液。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測克諾羅桿菌的試劑盒，其中包括所述的單克隆抗體或所述的雜交瘤細胞株。

在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：第二抗體，固相載體；較佳地，所述的單克隆抗體包被于所述的固相載體；較佳的，所述的第二抗體還連接有標記物。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：

與標記物相對應(yīng)的底物；

顯色劑；

洗滌液；和/或

終止液。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測克諾羅桿菌的試劑盒，其中包括所述的測試條。