[發明專利]一種桉樹TPS基因、RNA干擾載體及應用

有效

• 申請號: 201410269568.3
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN105002194B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 陳鴻鵬;謝耀堅
• 申請（專利權）人: 國家林業局桉樹研究開發中心
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

本發明通過PCR和RACE技術獲得了萜類合成酶(Terpene Synthase,TPS)基因，序列如SEQ ID NO15所示，選取如SEQ ID NO23和SEQ ID NO26所示的序列分別作為正向片段和反向片段構建了降低桉樹化感物質含量的RNA干擾載體pART27?TPS?RNAi。將該載體轉入桉樹中，成功獲得了低化感物質的植株。本發明為降低桉樹化感物質含量基因工程提供了一種重要的化感物質合成酶基因、RNA干擾表達載體以及應用，為RNA干擾及轉基因技術在林木分子育種中的應用提供了新的思路。實現了利用RNA干擾原理獲得低化感物質桉樹新材料的預期目標，為RNA干擾介導的桉樹分子育種及基因工程提供了成功的實例，彌補了RNA干擾介導的降低化感物質在本領域研究中的空缺。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種桉樹TPS基因、用其構建的用于桉樹遺傳轉化的降低化感作用的RNA干擾載體及在桉樹上的應用。

背景技術

桉樹(Eucalyptus)具有種類多、生長快、耐瘠薄、干形好、用途廣的特點，是我國華南各省區最重要和栽培面積最大的速生闊葉造林樹種。然而,桉樹的大量引種栽植，也帶來了一些頗具爭議的生態環境問題，如土壤退化、土地生產力下降、生物多樣性減弱等。其中，化感作用是桉樹人工材生態系統中頗受關注的生態現象，其表現形式是抑制其他植物及林下植被甚至土壤中的微生物生長，導致林地群落結構簡單、生物多樣性減弱和生態環境退化等現象，它對桉樹人工林群落的結構、功能、效益及發展均具有重大影響。

目前國內外關于桉樹化感作用的研究已有不少的報道，取得的主要成果是桉樹化感物質成分分析、化感物質的釋放途徑以及化感作用的生物測定等^]，而有關桉樹化感物質的生物合成途徑和代謝調控機理等方面的研究尚未報道。研究表明，桉樹化感物質的主要成分為a-松油醇(a-Terpineol)和桉葉油素(1,8-Cineole)等萜類化合物。在其他已知的一些生物中，萜類物質的生物合成主要由萜類合成酶(Terpene Synthase，TPS)家族催化完成。首先，牻牛兒基焦磷酸鹽(Geranyl-PP，GPP)在TPS的催化下，生成a-松油醇，之后a-松油醇進一步在TPS的催化下生成1,8-桉葉油素；此外，牻牛兒基焦磷酸鹽GPP在萜類合成酶TPS的催化下還可以分別生成a-蒎烯(a-Pinene)和β-蒎烯(β-Pinene)。因此，可以推測在桉樹化感物質的生物合成途徑中，萜類合成酶(TPS)對a-松油醇和1,8-桉葉油素的形成有著重要的調控作用。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。由于使用RNA干擾技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。例如，畢海紅在2008年利用RNA干擾技術，通過轉基因方式使水稻中AOS基因發生了沉默，由此降低了水稻的化感作用。Kazuaki等(2010)利用紫蘇(Perilla frutescens)中的檸檬烯合成酶(limonene synthase,LS)基因對赤桉實生苗的下胚軸進行了轉基因研究，結果表明轉基因桉樹葉片中的檸檬烯含量是野生型的4～5倍。

但是，桉樹中a-松油醇和桉葉油素的關鍵調控基因仍未見記載，更未有利用其構建干擾載體應用到桉樹上降低桉樹的化感作用的記載，因此有必要在這個方向進行進一步的研究。

發明內容

本發明的目的是從桉樹中克隆出一條桉樹萜類合成酶(Terpene Synthase,說明書及權利要求書中一般簡稱為TPS)基因的全長cDNA；并構建相關的RNA干擾載體，此載體包含TPS基因的部分核苷酸序列；再用該干擾載體轉化桉樹調節其a-松油醇和桉葉油素的合成，以降低桉樹的化感作用。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：