[發(fā)明專利]雜交瘤細(xì)胞株及基于雜交瘤細(xì)胞株的抗Nodal抗體和檢測腫瘤細(xì)胞方面的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410268890.4
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN104087557B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜軍;蔡紹暉
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/22;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;C12R1/91
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雜交瘤細(xì)胞株及基于雜交瘤細(xì)胞株

的抗Nodal單克隆抗體和多克隆抗體及檢測腫瘤細(xì)胞方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，早期診斷癌癥的最便捷的方法是通過驗(yàn)血尋找腫瘤標(biāo)志物，腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中能反映細(xì)胞惡變的一些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。臨床上通過對各種腫瘤標(biāo)記物的檢測，可以對輔助相應(yīng)腫瘤做早期診斷、判斷預(yù)后、檢測療效和腫瘤復(fù)發(fā)狀況的判斷等。

Nodal屬于TGF-β家族成員，它是一胚胎期高表達(dá)、而在成體組織中幾乎沒有表達(dá)的蛋白質(zhì)。Nodal在細(xì)胞內(nèi)以無活性的前體形式存在，在經(jīng)過一系列加工修飾除去N端信號肽和一段包含200多個氨基酸的前肽序列后，便形成由110個氨基酸的成熟Nodal蛋白被分泌至胞外，成熟Nodal蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，分子量約為12kDa（人和小鼠的結(jié)構(gòu)非常接近，氨基酸一致性達(dá)98.29%）。其中，通過比對TGF-β家族蛋白分析所得Nodal高特異性序列如SEQ?ID?NO:2所示。Nodal蛋白的功能是介導(dǎo)胚胎發(fā)育中外胚層的上皮細(xì)胞向內(nèi)、外胚層之間遷徙以形成間質(zhì)組織。已知在胚胎發(fā)育過程中，Nodal信號主要通過細(xì)胞膜上絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樣I型受體（ActRI）和II型受體（ActRII）的介導(dǎo)傳入胞內(nèi)。活化的ActRI?（ALK4或ALK7）隨即激活胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白Smad?(Sma/Mothers?Against?Decapenta-plegic)家族的Smad2/Smad3復(fù)合物。此后該復(fù)合物與Smad4形成具有活性的三聚體并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核內(nèi)，結(jié)合到目的基因的順式作用元件或啟動子區(qū)域，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與了腫瘤惡性生物學(xué)行為的發(fā)生過程。

新近，人們發(fā)現(xiàn)Nodal蛋白在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多數(shù)腫瘤中再度表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)系。因此，通過檢測血清中Nodal蛋白的表達(dá)情況，有望成為一種更加快速、方便、準(zhǔn)確廣泛的腫瘤體外普查診斷方法。

目前，對血清中蛋白的表達(dá)情況監(jiān)測方法通常需要用到抗體，因此，研制一種效價高、特異性好的Nodal蛋白抗體十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對Nodal蛋白抗體及其相關(guān)技術(shù)的不足，提供一種雜交瘤細(xì)胞株，基于所述雜交瘤細(xì)胞株，可以產(chǎn)生優(yōu)異的抗Nodal的抗體。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供抗Nodal的單克隆抗體或多克隆抗體。

本發(fā)明要解決的還一技術(shù)問題是提供抗Nodal的單克隆抗體或多克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明基于上述應(yīng)用，提供一種將可以應(yīng)用于用于腫瘤檢測方面的試劑盒。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

提供一種雜交瘤細(xì)胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為雜交瘤細(xì)胞，保藏編號為CGMCC?NO.9105。

本發(fā)明提供優(yōu)選的上述雜交瘤細(xì)胞的制備方法為：

以SEQ?ID?NO:1所示序列的成熟Nodal蛋白為待測物，采用Elisa法進(jìn)行活性篩選得到第一陽性克隆，以SEQ?ID?NO:2所示序列的特異性Nodal蛋白為待測物，采用Elisa法進(jìn)行特異性篩選得到陽性克隆，經(jīng)3次亞克隆至陽性克隆率為100%，制得雜交瘤細(xì)胞，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.9105。

本發(fā)明提供一種抗Nodal的單克隆抗體，由保藏編號為CGMCC?NO.9105的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

基于所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的所述單克隆抗體的類型為IgG，具有良好的特異性與較高的效價。經(jīng)檢測，其效價可達(dá)1:1024000，在Western?Blot檢測中，本發(fā)明提供的抗體僅識別目標(biāo)位置的Nodal特異性條帶，且在稀釋2000倍后仍顯示良好的特異性。

本發(fā)明提供所述抗Nodal的單克隆抗體的應(yīng)用，尤其是在制備檢測Nodal蛋白的檢測工具中具有較好的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的單克隆抗體在制備檢測腫瘤細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，腫瘤為結(jié)腸癌、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌或黑色素瘤。

本發(fā)明提供所述單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

S01：以Nodal蛋白與弗氏完全佐劑混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾細(xì)胞；