[發明專利]四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法

在審

• 申請號: 201410268727.8
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104067931A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 魏躍;王全智;顏志明;楊寶林;董慧;嵇怡;賈思振;史紅林
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;A01H1/08
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

1.一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）二倍體矮牽牛減數分裂前期Ⅰ時花蕾大小的確定；

（2）當花蕾長度為2.5-3.0mm時進行2n雄配子誘導，得到的含有2n花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2n花粉的染色體數為2x?=14；

（3）有性多倍化雜交：以四倍體矮牽牛為母本，并對母本進行去雄處理，去雄處理后的母本與步驟（2）中的父本進行授粉雜交得到F₁；

（4）雜交后代F₁倍性的鑒定：第二年春季播種F₁種子，成株后進行農藝性狀、解剖學鑒定，鑒定后選取配子染色體數目2x?=14的植株即為通過有性多倍化途徑獲得的新四倍體種質。

2.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟（1）中，于晴天上午8:00至10:00取二倍體矮牽牛幼小花蕾，測量其長度后用卡諾氏固定液固定24?h，經體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉入體積濃度為70%乙醇4℃下保存備用；用l?N鹽酸60℃恒溫水浴花蕾約2-3?min，蒸餾水沖洗3-4次，從花蕾中剝取花藥，用質量濃度為1%醋酸洋紅染色常規染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對花粉母細胞減數分裂期進行觀察，確定前期I時花蕾的長度；其中卡諾氏固定液是由無水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合制得。

3.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟（2）的操作方法為：采用秋水仙素溶液處理花蕾時間為早晨8:00-10:00，處理溫度25℃-32℃，誘導二倍體矮牽牛產生2n花粉的秋水仙素溶液質量濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%，在二倍體矮牽牛花蕾（不包括萼片）為2.5-3.0?mm時進行處理，采用微量注射法，將注射器針頭深入花蕾中注射9-11uL秋水仙素溶液，每天處理1次，分別進行1、2、3天處理，開花后套袋隔離，以未誘變處理二倍體植株為對照；然后取花粉粒于載玻片上質量濃度為1%醋酸洋紅染色3min后，在40倍鏡下用顯微測微尺測量花粉的直徑并結合外觀特征確認2n花粉，統計2n花粉百分率，其中2n花粉百分率的計算公式為：

2n花粉百分率=2n花粉數/花粉總數×100%。

4.根據權利要求1或3所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟（2）中得到的父本2n花粉形態特征為圓形或近似四邊形，直徑≧40um，有4個萌發孔，染色體數為?2x?=14。

5.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟（3）中所述的四倍體矮牽牛為‘紅霞’。

6.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟（4）中解剖學鑒定方法為：于晴天上午8:00-10:00取的植株上長度為2.6-5.8?mm幼小花蕾（不包括萼片），用卡諾氏固定液固定24?h后，經體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉入體積濃度為70%乙醇4℃下保存備用；用l?N鹽酸60℃恒溫水浴花蕾約2-3?min，蒸餾水沖洗3-4次，從花蕾中剝取花藥，用質量濃度為1%醋酸洋紅染色常規染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對花粉母細胞減數分裂期染色體數目進行計數，選取配子染色體數目2x=14的雜交后代植株即為通過有性多倍化途徑獲得的新四倍體矮牽牛種質。