[發(fā)明專利]一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410267885.1
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104032016A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李顯耀;吳桂賢;劉麗英;齊玉凱;王莎莎
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將白來航蛋雞分為試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組接種腸炎沙門氏菌，對照組接種磷酸鹽緩沖液，接種后第7天采集腸道組織樣品，用試劑盒提取總RNA；

2)試驗(yàn)組隨機(jī)選取6-9個個體，混池建3個庫：Tp1，Tp2，Tp3，對照組隨機(jī)選取5-6個個體，混池建3個庫：Cp1，Cp2，Cp3；

3)采用Illumina?Hiseq2000測序平臺的單端50bp測序模式對樣本進(jìn)行高通量測序；

4)測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)引物與接頭序列去除，并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測序片段用于后續(xù)分析；

5)統(tǒng)計microRNA的種類及數(shù)量，并對microRNA做長度分布統(tǒng)計；

6)參考基因組比對

將樣本預(yù)處理后的干凈數(shù)據(jù)讀數(shù)與參考基因組序列比對，已知microRNA前體及成熟體比對統(tǒng)計信息；

7)Rfam數(shù)據(jù)庫比對

選取Rfam10.1數(shù)據(jù)庫來注釋測序得到的microRNA序列，盡可能的發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的核糖體RNA，胞質(zhì)microRNA，核仁microRNA，核內(nèi)RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA；

8)microRNA表達(dá)量計算

非編碼microRNA表達(dá)量計算是將與參考基因組序列匹配的干凈讀數(shù)，采用cufflink軟件，并通過統(tǒng)計學(xué)方法計算每條microRNA表達(dá)量，microRNA表達(dá)量計算采用FPKM計算度量指標(biāo)，計算microRNA區(qū)間內(nèi)microRNA表達(dá)量；

9)microRNA差異表達(dá)分析及預(yù)測新microRNA

10)microRNA靶基因預(yù)測

針對差異表達(dá)分析得到的microRNA，利用miRanda算法預(yù)測來自比對組所得到的差異microRNA的靶基因，miRanda算法從(1)microRNA-3′非翻譯區(qū)序列匹配與(2)能量穩(wěn)定性評估計算的二部計算預(yù)測步驟綜合預(yù)測microRNA的靶基因；

11)microRNA靶基因基因本體功能分析

基因本體功能聚類常用于對目標(biāo)組基因特征進(jìn)行功能注釋與分類，即差異表達(dá)microRNA的預(yù)測靶基因的功能聚類分析，采用基因本體注釋系統(tǒng)，針對高度可信度靶基因預(yù)測結(jié)果展開分析，富集度分析采用超幾何分布算法，并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計量的P值，獲得校正后P值，即Q值；

12)microRNA靶基因生物通路功能分析

生物通路分析采用京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集度分析；

13)腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的鑒定

整合microRNA本身結(jié)果與其靶基因功能分析結(jié)果，獲得雞與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，其特征在于，所述相關(guān)microRNA具體為：

gga-miR-490-5p其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

gga-miR-216a其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

gga-miR-193a-3p其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

gga-miR-133b其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；

gga-miR-215-5p其核苷酸序列如SEQID?NO：5所示；

gga-miR-147其核苷酸序列如SEQID?NO：6所示；

gga-miR-1662其核苷酸序列如SEQID?NO：7所示。