[發(fā)明專利]一種綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養(yǎng)、凍存及復蘇的方法

有效

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• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104004708A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 吳應積;羅奮華;張巖;劉林洪;薩初拉
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 李靜

1.一種綿羊精原干細胞分離純化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步：配制溶液：

1)將體積百分比為0.1％的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養(yǎng)液中制成培養(yǎng)液A，兩周內使用；

2)將IV型膠原酶以20mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養(yǎng)液中制成IV型膠原酶儲備液，-20℃保存；

3)將透明質酸酶以10mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養(yǎng)液中制成透明質酸酶儲備液，-20℃保存；

4)將DnaseI以5mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養(yǎng)液，再加入體積百分比為20％的甘油，制成DNaseI儲備液，-20℃保存；

5)將體積百分比為0.5％的Trypsin和濃度為2mM?EDTA溶于PBS緩沖液中制成Trypsin/EDTA儲備液，-20℃保存；

6)將體積百分比為10％的胎牛血清和0.1％的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養(yǎng)液中制成培養(yǎng)液C，兩周內使用；

7)將體積百分比為5.5％的馬血清、2.4％的胎牛血清和0.1％的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養(yǎng)液中制成培養(yǎng)液B，兩周內使用；

8)將30μΜ的β-硫基乙醇加入培養(yǎng)液C中，過濾滅菌制成培養(yǎng)液D，現(xiàn)配現(xiàn)用；

9)將體積百分比為0.52％的牛血清白蛋白溶于PBS緩沖液中，過濾滅菌制成PBS-BSA溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；

第二步：應用兩步酶解法制備綿羊睪丸組織單細胞懸浮液，無菌條件下操作步驟依次如下：

1)從3-4月齡的綿羊睪丸中取2-3g曲細精管組織塊，放入載有2.5ml培養(yǎng)液A的100ml培養(yǎng)皿中，用鑷子除去曲細精管組織塊上的睪丸白膜和較大的血管；

2)將所剩的組織塊放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持續(xù)剪3分鐘；

3)將剪碎的組織塊轉移到一個100ml帶蓋的大口瓶中，補加培養(yǎng)液A至7.5ml；

4)進行第一步酶消化，具體操作如下：在上述100ml帶蓋的大口瓶中加入0.63ml的IV型膠原酶儲備液，置于37℃水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩40min；然后加入0.825ml的透明質酸酶儲備液和0.125ml的DNaseI儲備液，繼續(xù)置于37℃水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩20min。

5)從水浴搖床中取出100ml帶蓋的大口瓶，用10ml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；

6)將步驟5)所述100ml帶蓋的大口瓶中的懸浮液轉入50ml離心管，以2000rpm的轉速離心6min，除去上清液；

7)在步驟6)所述離心管中加入12ml的PBS緩沖液，搖勻使沉淀物重新懸浮，以2000rpm的轉速離心6min，除去上清液；

8)重復步驟7的操作一次；

9)進行第二步酶解，在步驟8)所述離心管中加入0.75ml的培養(yǎng)液A重新懸浮沉淀物，再加入1ml的Trypsin/EDTA儲備液和0.25ml的DNaseI儲備液，置于37℃水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩10min，用10ml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；

10)在步驟9)所述離心管中加入10ml的培養(yǎng)液C，用10ml移液管溫和地上下吸吹懸浮物直到明顯的塊狀物消失；

11)將步驟10)所述離心管以2000rpm的轉速離心6min，除去上清液，然后用2ml培養(yǎng)液C重懸細胞；

12)先用200目尼龍過濾器然后用300目尼龍過濾器分別過濾步驟11)所述細胞懸浮液；

13)將步驟12)所述的過濾后的細胞懸浮液用10ml移液管溫和地吸吹5-10次，進行細胞計數(shù)，然后加入培養(yǎng)液C調整細胞密度至1.25x10⁶細胞/ml，制成單細胞懸浮液；

第三步：從第二步所述單細胞懸浮液中純化精原干細胞，操作步驟依次如下：

1)將10ml第二步步驟13)所述的單細胞懸浮液鋪于直徑為100mm的明膠包被培養(yǎng)皿，放在32.5℃,5.5％CO₂，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2天半至3天半；

2)用5ml移液管從步驟1)中所述培養(yǎng)皿中溫和地移除所有培養(yǎng)液；

3)先用培養(yǎng)液A洗細胞：從培養(yǎng)皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的培養(yǎng)液A，溫和地來回晃動培養(yǎng)皿1次，然后用移液管移除培養(yǎng)液；

4)再用PBS緩沖液洗細胞兩次：從培養(yǎng)皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的PBS緩沖液，溫和地來回晃動培養(yǎng)皿1次，立即用移液管移除上清液，再重復操作一次；

5)加4ml培養(yǎng)液A至培養(yǎng)皿中，用移液管吸吹培養(yǎng)液A輕輕沖洗培養(yǎng)皿整個表面大約2遍；

6)將步驟5)所述培養(yǎng)皿中的沖洗液轉移到無菌的50ml離心管中；

7)將步驟6)所述離心管于2000rpm離心6min，移去上清液，保留細胞沉淀；

8)在步驟7)所述離心管中加入4ml的培養(yǎng)液B重懸細胞；

9)在collagen?Ⅰ包被的培養(yǎng)皿中加入4ml培養(yǎng)液B，再鋪上步驟8)所述細胞懸浮液，然后將培養(yǎng)皿放進32.5℃、5.5﹪CO₂、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時；

10)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，用5ml移液管溫和地在培養(yǎng)皿表面反復吸吹5-10次，使細胞混合，再將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時；

11)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿后，用5ml移液管在培養(yǎng)皿中溫和地吸吹細胞懸浮液，直至沖洗過整個培養(yǎng)皿表面，再用5ml移液管從培養(yǎng)皿中收集collagen?Ⅰ不吸附的細胞懸浮液，全部轉移到50ml離心管中；

12)將步驟11)所述離心管在2000rpm下離心6min，沉淀細胞，除去上清液，用4ml培養(yǎng)液D懸浮細胞，然后吸取細胞懸浮液通過200目尼龍過濾器，用50ml試管收集濾液；

13)迅速地將步驟12)得到的濾液用5ml移液管溫和的吸吹4-5次，然后將混合好的濾液按每孔1ml鋪入Laminin包被的12孔培養(yǎng)板，其中所述培養(yǎng)板預先準備好，臨用時先移除每個孔中的上清液，再加入1ml培養(yǎng)液A清洗，移除所有培養(yǎng)液A后才鋪入上述濾液；

14)將步驟13)所述培養(yǎng)板置于32.5℃，5.5﹪CO₂，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育20-40分鐘，然后取出，用1ml微量移液管非常溫和的吸吹所述培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔表面一遍，使孔中的細胞懸浮液上下層混合，然后迅速放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育10-30分鐘；

15)將步驟14)所述培養(yǎng)板取出，用1ml微量移液管吸吹一次，使孔中細胞懸浮液混合均勻，此時懸浮液中的細胞為Laminin不粘附細胞，將這些細胞懸浮液從培養(yǎng)孔中移走，然后，立即在培養(yǎng)孔中加入1ml新鮮配制的培養(yǎng)液D，再用1ml微量移液管吸吹培養(yǎng)孔表面一遍，然后移走培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液D，立即再次向孔中加入1ml新鮮配制的培養(yǎng)液D。培養(yǎng)液D要溫和且均勻地滴加在孔的整個表面，孔中粘附的細胞為Laminin粘附細胞；

16)用1ml微量移液管從步驟15)所述培養(yǎng)孔中移走培養(yǎng)液D，然后立即向培養(yǎng)孔內加入1ml新鮮配制的PBS-BSA溶液，然后將培養(yǎng)板放入32.5℃，5.5﹪CO₂，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內，孵育3-6分鐘，同時在一個50ml的無菌試管中加入4ml培養(yǎng)液D備用。

17)將步驟16)所述培養(yǎng)板取出，立即用1ml移液管在培養(yǎng)孔中溫和的吹吸PBS-BSA溶液5-10次，使Laminin粘附細胞從培養(yǎng)孔上脫壁，收集含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液，將含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液轉移到含有培養(yǎng)液D的50ml離心管中；

18)將步驟17)所述離心管在2000rpm轉速下離心6min，移除上清液，倒轉試管，溫和地除去剩余的液體；

19)在步驟18)所述離心管中加入1ml培養(yǎng)液D重新懸浮細胞，用細胞計數(shù)板測定細胞密度；

20)通過免疫熒光細胞染色法鑒定步驟19)所述細胞懸浮液中的細胞就是綿羊精原干細胞。