[發明專利]一種角膜的脫細胞方法

有效

• 申請號: 201410265612.3
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104001217A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 王維博;張斌
• 申請（專利權）人: 深圳艾尼爾角膜工程有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/24
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國;肖小紅

技術領域

本發明涉及醫療器械領域，尤其涉及一種角膜的脫細胞方法。

背景技術

角膜病是全球范圍內第二致盲眼病，并且以每年150～200萬病例的速度遞增。角膜移植是目前治療角膜盲唯一有效的方法，但供體角膜來源的極端匱乏制約著角膜移植的開展。角膜基質如動物等動物的角膜基質具有與人角膜基質類似的組織結構、生物物理特性和光學特性，但異種移植后強烈的排斥反應阻礙了異種角膜在臨床上的應用。近年來的研究發現，角膜基質內的基質細胞是引起基質型排斥反應的主要抗原，而作為角膜基質架構的膠原纖維在種系間高度保守，抗原性很低，無細胞的異種角膜移植后不產生排斥反應。因此，將動物的基質細胞完全脫去，使之成為無細胞的角膜基質可能是人角膜基質的理想替代物。

但現有技術生產的無細胞角膜基質在脫細胞過程中，采用的是胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)、脫氧膽酸鈉、SDS(十二烷基磺酸鈉)等表面活性劑，此類方法雖然能去除細胞成分，但反應劇烈，對角膜基質破壞嚴重，其中使用胰酶處理易導致角膜基質降解，使用表面活性劑易導致表面活性劑殘留，產生細胞毒性，在移植后容易引起毒性反應，不能達到良好的生物相容性。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種去除角膜中免疫原細胞成分和可溶性蛋白的同時能夠完整保留角膜基質膠原結構的角膜脫細胞方法，從而提高脫細胞角膜基質的生物相容性和抗降解能力。

為了實現上述目的，本發明提供一種角膜的脫細胞方法，包括以下步驟：

A、將摘取的動物角膜置于水中，振蕩處理，以使上皮層脫落；

B、將所述角膜置于脫細胞試劑中，振蕩處理；

C、將所述角膜置于水中，振蕩處理；

D、交替重復步驟B和步驟C，以使基質細胞和內皮細胞脫落；

其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA。

優選地，所述脫細胞試劑為：濃度為2～5mol/L的NaCl溶液與濃度為0.5～5g/L的EDTA溶液的混合液。

優選地，所述脫細胞試劑的PH值為7.0～7.4；所述脫細胞試劑和/或水的溫度為2～37℃。

優選地，所述NaCl溶液的濃度為3mol/L，所述EDTA溶液的濃度為3g/L。

優選地，所述步驟A的振蕩時間為5～10h，期間，每隔1～2h更換一次水。

優選地，所述步驟B的振蕩時間為1～2h。

優選地，所述步驟C的振蕩時間為1～2h。

優選地，在實施所述步驟D的持續時間內，每隔1～2h更換一次脫細胞試劑或水。

優選地，所述步驟A、步驟B、步驟C或步驟D的振蕩轉速為100～200rpm。

本發明采用物理脫細胞方法，通過脫細胞試劑和水的交替使用，反復改變組織滲透壓，能夠有效的去除容易引起免疫反應的角膜細胞成分和可溶性蛋白，同時，本發明所使用的試劑溫和，能夠完整的保留角膜基質膠原結構。

附圖說明

圖1為本發明的角膜脫細胞方法一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片對比圖，其中，1A為脫細胞處理前的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，1B為脫細胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖；

圖2為本發明的角膜脫細胞方法一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理后的透射電鏡照片對比圖，其中，2A為脫細胞處理前的透射電鏡照片圖，2B為脫細胞處理后的透射電鏡照片圖。

圖3為采用本發明的角膜脫細胞方法進行脫細胞之后，移植給兔的動物實驗60天后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片對比圖，其中，3A為移植前且未經脫細胞處理的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，3B為經脫細胞處理移植后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖。

本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。

具體實施方式

應當理解，此處所描述的具體實施方式為實現本發明目的的最佳實施方式，其僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明提供一種角膜的脫細胞方法，在第一實施例中，所述角膜的脫細胞方法包括以下步驟：