[發(fā)明專利]殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410265205.2
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104073478A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 嚴(yán)亞賢;黃慶慶;孫建和;吉文匯
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/06;A61K38/51;A61P31/04
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途。

背景技術(shù)

豬鏈球菌是一種人獸共患病原菌，可引起人腦膜炎、仔豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等疾病，嚴(yán)重的可致人死亡。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該菌莢膜抗原血清型有35種以上，大多數(shù)致病性血清型在1-9型，其中豬鏈球菌2型為最常見和毒力最強的血清型，流行最廣，對豬的致病力也最強，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，在公共衛(wèi)生方面，對相關(guān)從業(yè)人員的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，對于豬鏈球菌病的治療主要是抗生素治療。近幾年由于養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用，導(dǎo)致細菌的耐藥性也逐漸加劇，因此抗生素治療已面臨巨大的挑戰(zhàn)。

同樣，金黃色葡萄球菌也是一種人獸共患病原菌，可致人和動物的多種疾病。多重耐藥性金黃色葡萄球菌呈全球性擴散、傳播，嚴(yán)重威脅著人類健康。由于金黃色葡萄球菌不斷進化，對抗生素的耐藥性越來越強，它的高擴散性和高致病性，已經(jīng)導(dǎo)致世界各國出現(xiàn)越來越多的臨床病例難以治愈，因而對人類健康的威脅也越來越大。因此，在抗生素對耐藥性金黃色葡萄球菌無能為力的情況下，亟需一種全新的抗菌制劑來防控其感染與傳播。

通過細菌基因組的分析，發(fā)現(xiàn)在細菌的全基因中還有很多基因的功能未知，有的大概預(yù)測了某個基因的功能，但并沒有被開發(fā)利用。這些基因有的是細菌本身具有的，有的是細菌在漫長的進化過程中通過一些特定的基因重組事件獲得的外源基因或構(gòu)件。其中細菌中原噬菌體基因組構(gòu)件的存在就是一個典型的基因重組案例，原噬菌體不但能夠介導(dǎo)宿主菌生物學(xué)特性的改變，還能夠影響宿主菌的繁殖周期，決定宿主菌的溶原和裂解狀態(tài)。在裂解過程中噬菌體在感染細菌后期表達一類細胞壁水解酶，該酶可通過特異性水解氨基糖之間的糖苷鍵，即細胞壁肽聚糖上的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連接鍵，達到裂解細菌的目的，因此也稱為酶抗生素。與抗生素相比，這類水解酶特異性強，且不易使細菌產(chǎn)生抗性，也不會對宿主產(chǎn)生不良影響，是解決現(xiàn)在日趨嚴(yán)重的細菌耐藥性的一種可行性方法。然而目前所挖掘的具有實用性的水解酶還寥寥無幾，且大多數(shù)這類酶活性低或難以大批量生產(chǎn)，特別是同時能特異性裂解多重耐藥的鏈球菌和金黃色葡萄球菌的酶抗生素還未見報道，本發(fā)明的突出優(yōu)勢就是解決了以上這幾個問題。

本發(fā)明通過基因篩選、克隆和表達獲得了一種重組蛋白質(zhì)，通過生物活性的檢測，確定其對鏈球菌和金黃色葡萄球菌的裂解活性、裂菌譜以及裂菌效率，并優(yōu)化了保持該重組蛋白最佳活性的緩沖液、pH值、保存溫度等，確定該重組蛋白為特異、高效裂解多種血清型的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌的新型生物制劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途；具體是一種能夠高效殺滅多種血清型豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及多重耐藥的金黃色葡萄球菌的革蘭陽性菌的酶抗生素的篩選、制備、生物特性、裂菌方法、裂菌條件優(yōu)化及用途。本發(fā)明從豬鏈球菌基因組中篩選具有特定裂菌作用的基因，通過構(gòu)建原核表達載體，獲得具有裂菌活性的重組表達產(chǎn)物，確定其抗菌活性、裂菌譜、裂菌效率，以及影響表達產(chǎn)物活性的最優(yōu)裂解條件，提供一種能夠高效裂解多種血清型的多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌的新型裂菌制劑、用途。

本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)，能夠高效裂解多種血清型多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌，因此也稱酶抗生素。

第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼如上述蛋白質(zhì)的核苷酸。

優(yōu)選地，所述核苷酸的序列如SEQ?ID?NO.2所示。

第三方面，本發(fā)明涉及一種上述蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：根據(jù)最新文獻，在GenBank檢索相應(yīng)的基因序列，分析可疑編碼裂解酶的基因，設(shè)計引物，以豬鏈球菌菌株基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴增相應(yīng)的基因片段，片段大小為738bp；

步驟二：采用原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)，將步驟一擴增所得DNA序列構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-LySS7；

步驟三：將步驟二的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達載體(大腸桿菌BL21(DE3))中，篩選陽性克隆進行蛋白的誘導(dǎo)表達和鑒定，獲得重組蛋白LySS7，重組蛋白分子量為29.8kDa；

步驟四：采用平板裂解實驗，以一株豬鏈球菌2型為裂解菌，確定步驟三獲得的重組蛋白LySS7的裂菌特性；