[發明專利]一種優化的植物病毒接種方法

無效

• 申請號: 201410263717.5
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104152487A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 李向東;劉錦;叢倩倩;高瑞
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01G7/06
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于植物保護和植物病毒基因工程領域，提供了一種優化的植物病毒接種方法，具體是一種利用農桿菌大規模接種病毒的方法。

背景技術

通過基因工程手段，可以構建植物病毒的侵染性cDNA克隆，進而利用反向遺傳學技術明確調控病毒致病力的分子機制，由此獲得的弱毒株系可作為弱毒疫苗用來保護植株免受強毒株系的危害；也可以把病毒的侵染性cDNA克隆改造成植物表達載體，用來生產動物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。

限制植物病毒弱毒疫苗和表達載體應用的一個重要瓶頸是目前沒有適合在田間大規模接種的技術。根據不同植物病毒侵染性克隆的特點，可以通過基因槍接種，摩擦接種或是農桿菌浸潤等方法接種供試植物。基因槍接種需要昂貴的實驗器材，操作復雜，每批次可接種的植株數量極少。摩擦接種和農桿菌浸潤不需要復雜的儀器，但每批次可接種的植株數量也非常有限。這些方法只適合在實驗室內應用，不能滿足田間大規模接種的需要。

因此，生產中急需開發簡便高效、適合植物病毒弱毒疫苗與表達載體大規模接種的方法。

發明內容

針對現有接種方法無法滿足植物病毒弱毒疫苗與表達載體田間大規模接種需要這一問題，本發明提供了一種優化的適合田間大規模接種需要的病毒接種方法。

本發明主要是針對能在農桿菌中復制的侵染性克隆，利用了農桿菌在自然界可以通過自然孔口和傷口侵入植物這一現象，以接種細菌的方式來接種病毒。其包括如下步驟：將植物病毒弱毒疫苗與植物病毒表達載體轉化農桿菌，經過培養后離心收集菌體，重懸后稀釋到一定濃度，通過葉片噴霧的方式將菌體噴布到植物葉片表面。農桿菌可以通過自然孔口(例如氣孔)和微傷口侵染植物，從而將病毒基因組帶入植物細胞，使病毒在植物細胞內增殖并形成系統侵染。

本發明實施的具體技術方案是：將待接種病毒的侵染性克隆轉化農桿菌，培養后離心收集農桿菌菌體，將其稀釋到OD₆₀₀值為0.2-0.3，通過葉面噴施農桿菌接種植物病毒。接種煙草的最佳時期為四葉一心期至六葉一心期。

本方法操作簡單、成本低、效率高，不需要特殊的儀器設備，適合在科研溫室、育苗公司的育苗棚或大田應用，可在短時間內接種大量植株。

附圖說明

圖1采用本發明方法接種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP15天后普通煙的癥狀(A)及綠色熒光蛋白表達情況(B)

圖2利用本發明在普通煙三葉一心期噴霧結果示意圖

圖中A為接種后第六天，在紫外燈下可見普通煙葉片出現零星熒光斑點；B為接種后第七天，熒光斑點數目增加；C為接種后第八天，熒光斑點面積逐漸礦大，病毒通過葉脈向其它部位擴展；D為接種后第十天，普通煙上部葉片布滿綠色熒光。

圖3利用本發明在普通煙四葉一心期噴霧結果示意圖

圖中A、B、C、D分別為接種后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通煙植株上的擴展情況。

圖4利用本發明在普通煙六葉一心期噴霧結果示意圖

圖中A、B、C、D分別為接種后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通煙植株上的擴展情況。

圖5利用本發明接種的弱毒株系DDK對強毒株系的交叉保護效果

圖中A為先用噴霧法接種弱毒株系然后再接接種強毒株系的植株，幾乎看不到癥狀；B為直接接種強毒株系的植株，產生嚴重的花葉癥狀。

具體實施方式

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

實施例1：證明農桿菌噴霧可系統侵染普通煙并表達外源蛋白(以綠色熒光蛋白GFP為例)

1.病毒侵染性克隆轉化農桿菌

從-80℃冰箱中取出一管農桿菌GV3101的感受態細胞(100-200μl)，冰上解凍。解凍后加入100-300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP質粒。放入液氮中冷凍1-5min，取出后立即放入37℃水浴中5min。

加入800μl無抗生素的LB培養液，28℃搖床培養3h。5000r/min離心收集菌體，離心管中保留約200μl培養液并重新懸浮菌體。

在超凈臺上將菌體均勻涂布于含抗生素(本實驗中為卡那霉素、利福平霉素和四環素)的固體培養基平板，28℃培養2天，直至出現菌落。挑取單菌落進行PCR鑒定，證明菌落中含有病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP。