[發明專利]豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201410262677.2
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104004100A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 姜俊兵;武曉英;王志瑞;范闊海;杜文娟;郭夏斐
• 申請（專利權）人: 山西農業大學;太原師范學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

技術領域

本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程領域，具體是一種豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其編碼基因與應用。?

背景技術

????到目前為止，癌癥的發生率以及死亡率都在急劇攀升，雖然在癌癥研究付出了巨大的代價，但是由于諸多的原因給癌癥的治療帶來了巨大的困難。其中傳統化療藥物的廣泛使用導致的多重耐藥性的問題是主要原因之一，另外，化療藥物也存在嚴重的副作用。近年研究發現，一些抗菌肽除了抗微生物的活性外，對腫瘤細胞也具有殺滅作用。抗菌肽是生物體內產生的一類具有生物學活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優點，由于抗菌肽特殊的作用機制，使得病原微生物和腫瘤細胞不容易對其產生耐藥性。隨著研究的不斷深入，越來越顯示出了其在醫學、獸醫學等相關領域的獨特應用價值。NK-lysin由78個氨基酸殘基組成，屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白家族，是由自然殺傷細胞和T淋巴細胞分泌表達的一種具有抗微生物和抗腫瘤活性的多肽。NK-lysin蛋白對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生動物寄生蟲和腫瘤細胞都有溶解活性。將NK-lysin蛋白作為一種抗癌藥物進行開發和利用將產生很高的經濟價值和巨大的社會效益，但采用提取或合成的方法生產NK-lysin蛋白的工藝復雜，獲取量少，且成本較高，無法滿足市場需求，提高NK-lysin蛋白產量是一個急需解決的問題。?

發明內容

本發明利用豬抗菌肽NK-lysin和Pichiapastoris的優點，提供了一種豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其編碼基因與應用。?

本發明是通過以下技術方案實現的：豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。?

所述豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白在制備抑制腫瘤細胞藥物中的應用。?

所述豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白的編碼基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示。?

所述豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白的編碼基因是由編碼豬NK-lysin成熟肽的cDNA序列、6個組氨酸cDNA序列和限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ位點的cDNA序列以及符合酵母表達偏好性的基因序列組成的。?

本發明所述豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白的制備方法為：?

表達載體的構建：人工合成的NK-lysin的基因序列上設計有限制性內切酶的酶切位點，將NK-lysin的基因序列和表達質粒pwPICZalpha用同樣的限制性內切酶酶切后連接在一起，通過雙酶切檢測和篩選含有NK-lysin的基因序列的克??；

酵母表達系統的構建：使用限制性內切酶線性化重組表達質粒，通過電轉化的方法，將NK-lysin的基因序列整合到酵母的基因組中；將轉化后的菌體懸液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培養3-4d；挑取6個單菌落，進行小劑量的誘導表達，SDS-PAGE檢測表達上清確認陽性克隆；

重組蛋白的純化和活性檢測：挑選陽性克隆菌落進行大劑量的誘導表達，表達上清采用ProteinPure?Ni-NTA?樹脂和強陽離子交換樹脂純化，通過SDS-PAGE和Western?blot檢測純化的重組蛋白；利用BCA測定濃度，計算NK-lysin重組蛋白（融合蛋白）的產量。

本發明所述的豬抗菌肽NK-lysin融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichia?pastoris的優點，其編碼基因可以在Pichia?pastoris中高效表達，降低了抗菌肽的生產成本，將此融合蛋白在制備抑制腫瘤細胞藥物中的應用，是一種優良的抗癌藥物，具有很高的經濟價值和巨大的社會效益。?

附圖說明

圖1?是ProteinPure?Ni-NTA?樹脂純化NK-lysin的SDS-PAGE電泳圖。?

圖2?是強陽離子交換樹脂純化NK-lysin的SDS-PAGE電泳圖。?

圖3?是重組NK-lysin的Western?blot分析圖。?

圖4?是重組NK-lysin的殺傷腫瘤細胞的分析圖。?

具體實施方式

1、所用試劑及其配制?

（1）LB（Luria-Bertani）液體培養基：取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl5g，溶解于800mL?ddH₂O中，10M?NaOH調節pH至7.0，定容至1000mL，高壓滅菌（121℃，1.034×10⁵Pa）20min，4℃保存。