[發明專利]一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法

在審

• 申請號: 201410262316.8
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104004744A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 楊瑞金;唐樂樂;華霄;趙偉;張文斌
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，屬于食品加工技術領域。

背景技術

小麥是主要的糧食作物之一，我國小麥種植廣，產量大，但是存在―硬麥不硬，軟麥不軟‖的特點，小麥面筋含量不高，僅靠遺傳育種還不能在短期內改善小麥面粉的面筋品質，所以亟需開發安全有效的強筋劑。溴酸鉀是種極佳的強筋劑，它是一種慢速氧化劑，在醒發后期和焙烤期間作用更明顯，它能改善面團的流變性能，增強面團結構，提高面團的粘彈性，增加面包比容。但一些報道指出溴酸鉀具有致癌性，很多國家已經禁止使用。我國也于2005年7月1日起取消溴酸鉀作為面粉處理劑。

隨著溴酸鉀的禁用，以及人們生活水平的提高和健康意識的加強，綠色無公害的面粉改良劑—酶制劑成為當前研究的熱點，如戊聚糖酶、漆酶、己糖酶和葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶(GO)是最具潛力的替代溴酸鉀的酶制劑，已經被廣泛應用到實際生產之中。GO能將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫(H₂O₂)。過氧化氫是一種強氧化劑，在過氧化氫酶的催化下將面團中的巰基(-SH)氧化成二硫鍵(-S-S-)，使面筋蛋白發生氧化交聯，從而有利于形成面筋網絡結構，在面團形成過程中增強面筋強度，提高面團的持水能力、面包的比容和改善面包的質量。然而，GO在改善面包各項品質方面尚有許多不足之處，GO并不能完全取代溴酸鉀。首先，GO屬于快速氧化劑，在加水形成面團過程中就催化葡萄糖快速氧化，生成大量的H₂O₂，引起面團過度氧化，從而使面團變干變硬，導致最終的焙烤產品品質不佳；其次，GO在面團中的穩定性較差，易失活，且在焙烤期，會熱失活，起不到任何作用。

殼聚糖是自然界中唯一發現的帶陽離子性質的堿性多糖，具有生物降解、安全無毒害、生物相容等特點，在酶固定化方面顯示出了重要作用。殼聚糖壁材所具有的較大外表面積有助于GO的固定，同時還能降低過氧化氫的釋放速率，達到緩釋效果。

目前，國內外關于用固定化葡萄糖氧化酶作為面粉改良劑的研究甚少，江南大學俞超華(CN102422848A)用殼聚糖-三聚磷酸鈉(TPP)凝膠為壁材通過二步吸附法制備得到固定化葡萄糖氧化酶，先制得空白的殼聚糖-TPP微粒，再將GO溶液與微粒混合吸附制得含GO的微粒，但該法得到的殼聚糖-TPP-GO混合體系，固形物含量低，直接將混合體系用于噴霧干燥得到固定化葡萄糖氧化酶，耗時耗能，且噴霧干燥過程中酶活會因高溫有所損失，得率也較低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，提高固定化酶的產量。先由殼聚糖溶液和GO溶液制備殼聚糖-GO溶液，然后向殼聚糖-GO溶液中添加TPP水溶液，從而在載體形成的同時將GO包裹進去，形成固定化GO微粒。通過直接離心獲取沉淀，去除大量的含未固定化酶的上清溶液，降低干燥的成本，再經真空低溫干燥即可獲得固定化GO粉末。

所述殼聚糖和TPP的質量比為3:1-7:1；所述殼聚糖與GO的比例為3-7：1。

所述殼聚糖溶液優選將粘度700cps、脫乙酰度為90％的殼聚糖用體積濃度為0.1-2％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為0.5-3％殼聚糖溶液，用100-200目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質。

所述GO溶液優選用pH5.0-7.0的磷酸鹽緩沖液配置質量濃度為5-20mg/mL的GO溶液。所使用的GO是粉末狀，活力為10000U/g。

所述TPP水溶液優選質量濃度為4-16mg/mL的TPP水溶液，用0.45μm濾膜過濾，形成透明溶液。

所述殼聚糖-GO溶液的制備優選向殼聚糖溶液中通過恒流泵加入GO溶液，攪拌速度100-200r/min。

所述固定化GO微粒的制備優選將TPP水溶液在100-500r/min的攪拌速度下，以2-6mL/min的滴加速度緩慢加入到殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結束后，繼續攪拌0.5-1h，形成固定化酶分散體系。

本發明技術方案優選以下步驟：

(1)將粘度700cps、脫乙酰度為90％的殼聚糖用體積濃度為0.1-2％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為0.5-3％殼聚糖溶液，用100-200目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質；

(2)配置pH5.0-7.0的磷酸鹽緩沖液，用該緩沖液配置成質量濃度為5-20mg/mL的GO溶液；