[發明專利]一種Tat蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410259996.8
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104001155A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 張輝;耿冠男
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;C07K14/16;A61P31/18
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及一種抗病毒化合物，更具體地，涉及一種改良的Tat蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

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高效抗逆轉錄病毒治療（Highly?Active?Antiretroviral?Therapy，HAART）治療可以有效地將病人體內的病毒數量控制到檢測不到的程度，但是潛伏感染的HIV-1（人類免疫缺陷病毒一型）前病毒整合進宿主的基因組中形成儲存庫以后很難去除。病人必須長期用藥以抑制病毒復制，一旦撤藥就會造成病毒復制的回彈。怎樣清除HIV-1的潛伏感染已經成為徹底治愈艾滋病的瓶頸問題。

白介素2（Interleukin?2，IL-2）和anti-CD3等細胞因子曾被用于激活HIV-1的潛伏感染，這些細胞因子使細胞在整體水平上發生了激活，對機體造成了極大的毒副作用。多種組蛋白乙酰化酶抑制劑（Histone?Deacetylase?inhibitor,?HDACi）也是目前研究比較多的潛伏激活劑，一方面由于HDACi對基因的激活也是廣譜效應，容易引起其他基因的異常表達，另一方面在體外效果比較好的HDACi，如valproc?acid?(VPA)和Vorinostat?(即suberanilohydroxamic?acid,?SAHA)等，在臨床上的表現都不佳，不能夠投入實際應用。因此，尋找新的特異性強、高效而安全的潛伏激活劑是當務之急。

HIV-1?Tat是HIV-1特異性的反式激活因子，該蛋白特異地結合到HIV-1?5’LTR的TAR上，將HIV-1?mRNA的轉錄抬高數百倍。Tat?蛋白在HIV-1的潛伏感染中也是關鍵的因子。該蛋白帶有穿膜肽，被證明具有高效穿過細胞膜的功能；曾被設計作為HIV-1的疫苗進入臨床實驗使用，對人體相對安全。但Tat蛋白被證明具有誘導凋亡的功能，可能對免疫細胞功能造成影響。

發明內容

本發明的目的之一就是尋找一種新的抗HIV途徑，

首先提供一種Tat蛋白在制備抗HIV藥物中的應用，本發明采用的是TAT-86來證明效果。

???更進一步提供一種減毒Tat蛋白在制備抗HIV藥物中的應用，所述的減毒Tat蛋白氨基酸序列SEQ?NO:1、SEQ?NO:2、SEQ?NO:3、SEQ?NO:4所示。

???更進一步提供一種減毒Tat蛋白，所述的減毒Tat蛋白氨基酸序列SEQ?NO:1（R4M4）、SEQ?NO:2（R4M5）、SEQ?NO:3（R4M7）、SEQ?NO:4（R5M4）所示。

???進一步提供一種上述的減毒Tat蛋白的制備方法，其特征在于，首先選擇定點突變的位點，對這些位點在Tat的基因上進行定點突變，最終得到大量保留Tat?的反式激活功能，并去除其中凋亡和其他活性的減毒蛋白。

本發明具有以下優點：

1.?本發明的目的在于提供若干減毒的HIV-1?Tat蛋白用于激活HIV-1潛伏感染。

2.?本發明提供了一種利用HIV-1自身的反式激活蛋白Tat作為激活潛伏感染工具的思路，并且通過累計突變對Tat蛋白進行改造，使其在安全性上更加可靠。

3.?本發明提供四種減毒的Tat蛋白，能夠在細胞水平上特異性激活HIV-1潛伏感染。

4.?本發明提供了一種改良的HIV-1體外潛伏感染模型的構建方式。

5.?本發明提供一種減毒Tat蛋白跟SAHA聯用激活HIV-1潛伏感染的新方法。

6.?本發明提供的減毒Tat蛋白對免疫細胞的功能不造成影響。

7.?本發明發現Tat蛋白的具備較好的反式激活活性，能夠有效抬高HIV-1?mRNA的轉錄。

8.?Tat蛋白具備良好的穿膜活性，能夠有效進入細胞和各個組織發揮功能。

附圖說明

圖1：HIV1?Tat蛋白改造及篩選原理。

圖2：四種減毒Tat的模式圖。

圖3：四種減毒Tat能夠在Tzm-b1中激活HIV-1的啟動子。

圖4：Tat-R5M4的改造降低了細胞毒性和凋亡活性。

圖5：Tat-R5M4能有效地穿膜進入細胞以及各個組織。

圖6：HIV-1體外潛伏感染模型的構建。

圖7：Tat-R5M4能有效激活HIV-1體外潛伏模型。

圖8：Tat-R5M4能有效激活來自臨床病人外周血的潛伏感染狀態的CD4⁺T細胞。

圖9：急性毒性實驗和免疫原性檢測。

具體實施方式