[發(fā)明專利]利用無動(dòng)物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410259944.0
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104109653B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊黎明;邊金鐸;陳艷;張麗
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江瑞順生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 杭州天欣專利事務(wù)所(普通合伙)33209
• 代理人: 陳琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用無動(dòng)物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

TCR⁺CD3⁺CD4^-CD8^-T（Double Negative T，DNT）細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群。此類細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞表型（CD25⁺CD28loCD30⁺CD44^-）和細(xì)胞因子表達(dá)譜（IFN-r⁺、TNF-α⁺、IL-2^-、IL-4^-、IL-10^-、IL-13^-）。因此，DNT細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、自身免疫病、移植物抗宿主病、HIV感染以及抗腫瘤方面有重要作用。然而由于DNT細(xì)胞僅占外周血T淋巴細(xì)胞的1%~5%，并且缺少有效的方法進(jìn)行體外擴(kuò)增，使其研究較少。

專利號為200680043116.7，專利名稱為“擴(kuò)增雙陰性T細(xì)胞的方法”的中國專利中公開了一種擴(kuò)增方法：包括(a)提供包括DNT細(xì)胞或者其前體的起始樣品；(b) 從起始樣品基本上去除CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞；(c)在包括能夠刺激DNT細(xì)胞生長的試劑的培養(yǎng)基中用固定的T細(xì)胞促分裂原培養(yǎng)來自步驟(b)的樣品；(d)洗滌步驟(c)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑但無T細(xì)胞促分裂原的培養(yǎng)基中；和(e)洗滌步驟(d)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑和可溶性 T 細(xì)胞促分裂原的培養(yǎng)基中。上述技術(shù)方案是基于實(shí)驗(yàn)室的科研方法及操作，其主要缺陷是培養(yǎng)基中添加動(dòng)物血清，給臨床應(yīng)用帶來潛在危險(xiǎn)。DNT前期培養(yǎng)用6孔板或24孔板以及后期采用培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，其培養(yǎng)操作繁瑣，細(xì)胞瓶占用空間大，操作耗時(shí)耗力，增加污染的幾率，不適宜產(chǎn)業(yè)化；另外，其整個(gè)培養(yǎng)過程中繁瑣的細(xì)胞收集、離心、洗滌等操作程序，也不適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和管理的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)、可產(chǎn)業(yè)化、可用于臨床應(yīng)用的利用無動(dòng)物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：該利用無動(dòng)物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴(kuò)增人外周血DNT細(xì)胞的方法依次包括以下步驟：1）采集人體外周血樣品，2）體外分離純化獲得DNT細(xì)胞，3）體外培養(yǎng)DNT細(xì)胞，4）洗滌、收集DNT細(xì)胞，其特征在于：所述的步驟3）依次在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動(dòng)物血清培養(yǎng)基，再加上1 ~10v%的AB血清、1 ~-10v%的自體血漿或1 ~10v%的人血白蛋白中的一種或多種作為添加蛋白成分。本發(fā)明采用培養(yǎng)瓶而不是24孔或6孔培養(yǎng)板作為起始培養(yǎng)材料，操作簡易可控，減少污染的幾率。采用細(xì)胞培養(yǎng)袋而不是細(xì)胞培養(yǎng)瓶來大規(guī)模擴(kuò)增細(xì)胞，由此提高細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、減少細(xì)胞培養(yǎng)空間，有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和管理。采用無動(dòng)物血清培養(yǎng)基，由此避免了可能造成的種系間病原微生物污染及其它對細(xì)胞生長的不利因素，避免了可能帶來的安全隱患。

本發(fā)明所述的步驟3）中不收集、離心、洗滌細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)化起始培養(yǎng)材料，合理選擇培養(yǎng)基種類，因此在細(xì)胞擴(kuò)增過程中無需采用傳統(tǒng)的收集、離心、洗滌方式就能創(chuàng)造并維持細(xì)胞擴(kuò)增的良好環(huán)境同時(shí)減少細(xì)胞損失，所以大大簡略了細(xì)胞培養(yǎng)過程，節(jié)省人力、物力和時(shí)間，同時(shí)減少了細(xì)胞污染機(jī)會。

本發(fā)明所述的步驟4）之后將收集到的DNT細(xì)胞加入0.9w%的生理鹽水袋中，并添加100~1000 IU/ml的重組人白介素2和1 ~5v%的人血白蛋白。添加以上的成分，可大大提高細(xì)胞的穩(wěn)定性，為細(xì)胞建立一個(gè)良好的細(xì)胞保存環(huán)境，有效保留細(xì)胞的殺瘤活性。

本發(fā)明所述的步驟3）具體過程為：

0~3天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶已用1~10 μg/ml的抗人CD3單克隆抗體（克隆OKT3）包被，采用無動(dòng)物血清培養(yǎng)基，添加50~200 單位/ml的慶大霉素、100~1000 IU/ml的重組人白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4 、1~20ng/ml的重組人白介素7 、1~20 ng/ml的重組人白介素12、1 ~10v%的自體血漿和1 ~10v%的AB血清；