[發明專利]一種小核糖核酸的電化學檢測方法

有效

• 申請號: 201410259207.0
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN103993097A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 韓坤;繆鵬;王弼陡;唐玉國
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及小核糖核酸檢測技術領域，特別涉及一種對痕量小核糖核酸的電化學單分子檢測方法。

背景技術

microRNA(微小RNA)是一類長度約為21～25個核苷酸的小分子RNA，通過與mRNA(信使RNA)互補結合，在轉錄后水平抑制靶基因的表達microRNA普遍存在于多細胞生物中，而且數量可觀，約占整個基因組基因總數2％左右。microRNA在生物進化過程中高度保守，并已被證實參與和調控了包括時序發育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經元發育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程，以及包括肺癌、白血病在內的多種疾病發生過程。研發人員監測大量已知microRNA在免疫反應中表達的變化，從而發現其在生理病理狀態下的重要作用。除此之外研發人員還可以發現和鑒定出新的生物標志物，從而達到監測免疫細胞的信號轉導和組織器官的分化的目的。由于microRNA細胞特異性以及“時空”特異性的特點，近年來其在干細胞定向分化和自我更新功能維持中的作用，逐漸被科學家們發現。通過監測大量已知microRNA在免疫反應中表達的變化，研發人員可以在較短的時間內發現新的干細胞分化的標志microRNA；此外通過對已知的microRNA標志物表達量的檢測，可以達到對干細胞的多能性以及分化進行監測的目的。根據國內外的相關報告，某些microRNA在腫瘤的發生和發展中起著重要的作用。根據microRNA在人體中起到的調節蛋白生成的特殊作用，我們認為其在未來臨床檢測應用方面具有廣闊的前景。

現在常見的檢測靶標microRNA的方法有深度測序(Deep?Sequencing)基因芯片(Micro-Array)、實時熒光定量PCR(Real-time?qPCR)等。

上述方法大多需要大型、較昂貴設備的支持，檢測成本較高，不適合常規的分析檢測，因此需要發展一種簡單、成本低又靈敏的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單的檢測靶標微小RNA的方法。本發明所述電化學單分子檢測方法是一種非常簡便的分析方法，通過三電極系統中電信號的變化可以直接判斷出待測樣品中是否存在靶標微小RNA，操作簡單，抗干擾能力強，能快速、精確的實現對靶標微小RNA的檢測。

本發明提供一種靶標微小RNA的電化學單分子檢測方法，包括以下步驟：

步驟一?固定在工作電極表面的報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a，打開報告DNA的莖環結構；

步驟二?靶標microRNA與雙鏈a中的阻塞DNA結合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報告DNA自發形成莖環結構；

步驟三?引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA雙鏈c，同時將靶標microRNA置換下來；

步驟四?被置換下來的靶標microRNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發生反應；

步驟五?經過上述N次循環反應后，工作電極表面的莖環結構的報告DNA也越來越多，工作電極表面電信號會越來越強，從而實現對單分子微小RNA的電化學單分子檢測。

優選的，所述報告DNA5′端帶有可以修飾到電極表面的基團(如巰基，氨基等)，報告DNA3′端帶有電信號分子。

優選的，所述阻塞DNA通過與報告DNA互補配對被固定與電極表面，

但不是直接連接與工作電極表面。

優選的，所述阻塞DNA上有一段可以與靶標微小RNA配對的堿基序列。

優選的，靶標microRNA是可以重復利用的。

優選的，所述報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a時，報告DNA3′端電信號分子遠離金電極表面，電信號減弱。

優選的，所述報告DNA在單分子鏈狀態下形成莖環結構時報告DNA3′端帶有電信號分子，靠近工作電極表面，增強電信號。