[發(fā)明專利]利用基因組原位雜交快速構(gòu)建黃瓜中期染色體核型方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410257785.0
• 申請日: 2014-06-09
• 公開（公告）號: CN104004849A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 婁群峰;張云霞;張振濤;楊樹瓊;王筠竹;陳勁楓
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了利用黃瓜自身基因組原位雜交技術(shù)快速構(gòu)建黃瓜有絲分裂中期染色體核型的方法，有利于開展黃瓜及其它物種的核型分析研究，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。

二、技術(shù)背景

黃瓜(Cucumis?sativus?L.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜具有一些特殊的性狀，如性別表型多樣化、線粒體的父性遺傳性等；同時黃瓜的基因組相對較小(約370Mb)，染色體數(shù)目少，僅為14條，使得黃瓜成為近年來分子細胞遺傳學(xué)研究的模式物種之一。然而黃瓜中期染色體小，染色能力弱，且染色體間形態(tài)很相似，對其分子細胞遺傳學(xué)的研究雖然已有幾十年之久，但對其核型分析或染色體的識別往往需要借助多種復(fù)雜的方法。

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型。包括染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)的總和。染色體核型分析是細胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)(包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等)特征，而且這種形態(tài)特征是相對穩(wěn)定的。核型分析可以為細胞遺傳分類、物種間親緣的關(guān)系、以及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的研究提供重要依據(jù)。因此，在細胞遺傳研究領(lǐng)域中具有重要意義。

熒光原位雜交(Fluorescence?in?situ?hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，為準確鑒定植物染色體提供了有效的方法。Koo等(2005)利用隨機擴增多態(tài)性DNA(Random?amplified?polymorphic?DNAs，RAPDs)標記產(chǎn)物為探針的FISH研究，并結(jié)合C帶分析，準確識別出了每條黃瓜染色體。不久，Han等(2008)利用多種衛(wèi)星DNA，結(jié)合45S?rDNA、5S?rDNA在黃瓜染色體上分布的不同，對黃瓜有絲分裂中期的染色體核型進行了分析，并建立了核型模式圖。Zhao等(2011)利用多個重復(fù)序列探針及多個Fosmid克隆分別對黃瓜中期染色體進行了區(qū)分，并建立了FISH核型模式圖。最近，Lou等(2014)利用黃瓜單拷貝基因為探針與45S?rDNA相結(jié)合，識別出了每條黃瓜中期染色體。以上這些研究對于染色體的鑒定與識別，均需要制備多種不同類型的探針。前人的研究中，主要集中于利用C-分帶、染色體特異的克隆以及多種串聯(lián)重復(fù)序列等對黃瓜染色體核型進行分析，技術(shù)較為繁瑣。高等植物核基因組含有大量重復(fù)序列，如玉米基因組中含85％以上的重復(fù)序列。經(jīng)調(diào)查，黃瓜基因組中含有～20％-30％的衛(wèi)星DNA，而這些衛(wèi)星DNA中，90％以上都是串聯(lián)重復(fù)序列(Type?I，II，III，IV)。前人利用多個串聯(lián)重復(fù)序列(Type?I，II，III，IV，45S?rDNA等)探針組合的FISH雜交，根據(jù)不同探針在黃瓜染色體上信號分布及信號強度的不同，采用多次重復(fù)雜交的方法，對黃瓜有絲分裂中期染色體進行了準確的識別分析，然而，該方法同樣需要制備各種不類型的探針，技術(shù)流程較為繁瑣。基因組原位雜交能有效地反應(yīng)基因組中的重復(fù)序列分布特征，黃瓜基因組中的重復(fù)序列多為串聯(lián)重復(fù)序列，且在不同染色體上存在明顯特征性的分布模式，這為利用基于基因組原位雜交進行核型的構(gòu)建提供了可能。

目前，利用自身基因組熒光原位雜交分析，分析黃瓜基因組重復(fù)序列的分布特征，從而構(gòu)建黃瓜有絲分裂中期染色體核型的研究尚未見報道。我們利用黃瓜基因組DNA直接作為探針與黃瓜有絲分裂中期染色體進行雜交，可以直接揭示DNA序列沿染色體的分布模式。根據(jù)雜交信號在每條染色體上分布位置及信號強度的不同，成功對黃瓜有絲分裂中期的染色體核型進行了分析。

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明利用自身基因組原位雜交快速構(gòu)建黃瓜中期染色體核型方法的目的，是針對以往黃瓜有絲分裂中期染色體核型構(gòu)建方法的繁瑣等不足，發(fā)明了一種僅通過黃瓜自身基因組作探針的一次基因組原位雜交(genomic?in?situ?hybridization，GISH)即可快速構(gòu)建出黃瓜中期染色體核型的方法，加快了黃瓜的細胞遺傳學(xué)研究進展，并為其他物種的核型分析提供了新的方法與思路。

技術(shù)方案

本發(fā)明所提供的利用自身基因組原位雜交快速構(gòu)建黃瓜中期染色體核型，其特征在于：僅通過一次GISH試驗即可對黃瓜有絲分裂中期染色體進行準確的識別。

上述利用自身基因組原位雜交能夠快速構(gòu)建黃瓜中期染色體核型，是通過以下方法獲得的：