[發(fā)明專(zhuān)利]一種構(gòu)建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410257546.5
• 申請(qǐng)日: 2014-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103981202A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單虎;蔣文明;杜翔;黃娟;楊瑞梅;張傳美;秦志華
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/63
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/63;C12N15/85;C12N15/66;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種構(gòu)建CDV反向遺傳全基因載體的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：

1)首先設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CDV基因組不同片段的9對(duì)引物，引物的序列信息如下：

引物名稱(chēng)引物序列序列表順序F1f5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAT-3’SEQ?ID?NO:1F1r5’-AGTAAGCATCCTCATCTTGG-3’SEQ?ID?NO:2F2f5’-ATGAGGATGCTTACTAAGATGC-3’SEQ?ID?NO:3F2r5’-TGGATCTATTACTCTGACTTGG-3’SEQ?ID?NO:4F3f5’-AGAGTAATAGATCCAGGACTCG-3’SEQ?ID?NO:5F3r5’-AGGCACCACAGGACTAAC-3’SEQ?ID?NO:6F4f5’-CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT-3’SEQ?ID?NO:7F4r5’-ATCATATCACCTCCAGAGTATC-3’SEQ?ID?NO:8F5f5’-AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’SEQ?ID?NO:9F5r5’-GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT-3’SEQ?ID?NO:10F6f5’-ATGCTGACCGCTACCTCAGAC-3’SEQ?ID?NO:11F6r5’-GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’SEQ?ID?NO:12F7f5’-TAACATCGCCAACTCTACAACCA-3’SEQ?ID?NO:13F7R5’-CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA-3’SEQ?ID?NO:14F8f5’-TGATACTGCTATGGCAATTG-3’SEQ?ID?NO:15F8r5’-TCATCCGTAATTCCTCAAGT-3’SEQ?ID?NO:16F9f5’-GAGGAATTACGGATGATTACCC-3’SEQ?ID?NO:17F9r5’-ACCAGACAAAGCTGGGTATGA-3’SEQ?ID?NO:18

以提取的病毒核酸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用引物F1f和F1r擴(kuò)增得到片段F1；引物F2f和F2r擴(kuò)增得到片段F2；引物F3f和F3r擴(kuò)增得到片段F3；引物F4f和F4r擴(kuò)增得到片段F4；引物F5f和F5r擴(kuò)增得到片段F5；引物F6f和F6r擴(kuò)增得到片段F6；引物F7f和F7r擴(kuò)增得到片段F7；引物F8f和F8r擴(kuò)增得到片段F8；引物F9f和F9r擴(kuò)增得到片段F9；所有產(chǎn)物連接T載體得到F1～F9質(zhì)粒；

2)使用Ham?Rz?p1為上游引物和F1r為下游引物，以F1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到Ham?Rz+F1片段，將Ham?Rz+F1片段連接到T載體得到質(zhì)粒Ham?Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV?Rz?p1和HDV?Rz?p2為下游引物，以F9質(zhì)粒為模板，通過(guò)前后兩輪PCR得到F9+HDV?Rz片段，連接到T載體得到質(zhì)粒F9+HDV?Rz；

3)用引物Infusion_P1和F1r，以質(zhì)粒Ham?Rz+F1為模板；用引物F2f和F2r，質(zhì)粒F2為模板；用引物F3f和Infusion_P2，質(zhì)粒F3為模板進(jìn)行擴(kuò)增；三個(gè)產(chǎn)物依次連接入T載體為FA質(zhì)粒；

引物Infusion_P3和F4r以質(zhì)粒F4為模板的PCR產(chǎn)物；引物F5f和Infusion_P4以質(zhì)粒F5為模板的PCR產(chǎn)物，二個(gè)產(chǎn)物接入T載體為FB(-)質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒FB(-)和質(zhì)粒F4經(jīng)過(guò)Sac?I和Hpa?I雙酶切后連接為質(zhì)粒FB(+)；質(zhì)粒FB(+)和質(zhì)粒F7經(jīng)過(guò)Nco?I和Hind?III雙酶切連接成為片段質(zhì)粒FB；

引物Infusion_P5和F8r以質(zhì)粒F8為模板的PCR產(chǎn)物；引物F9f和Infusion_P6以質(zhì)粒F9+HDV?Rz為模板的PCR產(chǎn)物連接入T載體為FC質(zhì)粒；

引物名稱(chēng)引物序列序列表順序Infusion_P15’-GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG-3’SEQ?ID?NO:22Infusion_P25’-CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC-3’SEQ?ID?NO:23Infusion_P35’-GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’SEQ?ID?NO:24Infusion_P45’-CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’SEQ?ID?NO:25Infusion_P55’-GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG-3’SEQ?ID?NO:26Infusion_P65’-CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT-3’SEQ?ID?NO:27

4)將序列為SEQ?ID?NO:28和SEQ?ID?NO:29的Oligo?DNA溶解后退火形成雙鏈，然后將pVAX1載體用NheI和ApaI雙酶切后膠回收，與雙鏈連接形成載體pVAX2；

5)然后將片段FA、FB和FC酶切，再依次連入載體pVAX2得到CDV全基因組感染性克隆pVAX-rCDV。