[發明專利]植物寄生線蟲核糖體ITS區通用擴增引物新組合及其使用方法

有效

• 申請號: 201410257542.7
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN104032002A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 王金成;顧建鋒;林宇;郭京澤;牛春敬;陳先鋒;黃國明
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京億騰知識產權代理事務所 11309
• 代理人: 陳惠蓮

1.一種植物寄生線蟲核糖體ITS區通用擴增的引物組合，所述引物組合包括2對引物，其序列為：?

引物組合1：?

上游引物PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′?

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′?

引物組合2：?

上游引物F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′?

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′。

2.根據權利要求1所述的引物組合的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：?

步驟一、線蟲DNA的提取：?

首先用雙蒸水將線蟲清洗干凈，然后挑取單條線蟲放入含8μL?ddH₂O的PCR管中，再反復凍融2次后，加入2μL裂解液，最后56℃保溫1h，95℃加熱10min即可。經所述步驟提取獲得的上清液可用于后續的分子實驗；所述凍融為液氮處理1min，65℃水浴2min；所述裂解液為10×PCR?Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的體積比為10∶9∶1；?

步驟二、核糖體ITS區的PCR擴增：?

PCR擴增體系(25μL)：10×PCR?Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，rTaq?DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA5μL，雙蒸水15.3μL；PCR反應條件：94℃預變性3min；40個循環反應：94℃變性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保溫5min，使反應物充分延伸；?

步驟三、PCR產物的電泳檢測：?

每個樣品取3μL擴增產物，使用2％的瓊脂糖凝膠進行電泳，設置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統中觀察并拍照。?

3.根據權利要求2所述的使用方法，其特征在于：步驟二中PCR反應條件要求退火溫度為55℃。?

4.根據權利要求2所述的使用方法，其特征在于：所述線蟲為穿刺短體線蟲(Pratylenchus?penetrans)、玻利維亞短體線蟲(Pratylenchus?bolivianus)、斯氏短體線蟲(Pratylenchus?scribneri)、朱頂紅短體線蟲(Pratylenchus?hippeastri)、松材線蟲(Bursaphelenchus?xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、豆傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus?doui)、阿蘇里傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus?arthui)或水稻干尖線蟲(Aphelenchoides?besseyi)。?