[發明專利]高溫脅迫下褐飛虱內參基因的篩選方法及應用

有效

• 申請號: 201410256693.0
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN104178564A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 姜建軍;楊朗;黃立飛;陳紅松;王鳳英;黎柳峰;杜曉莉;馬琳
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于分子生物學中昆蟲體內穩定性表達內參基因技術領域，尤其涉及一種高溫脅迫下褐飛虱內參基因的篩選方法及應用。

背景技術

隨著現代人類工業的發展的影響，全球氣候正在逐漸變暖。昆蟲是變溫動物，溫度對昆蟲的影響至關重要。過高的環境溫度將直接使昆蟲的生長發育、繁殖、種群發展及生存等受到嚴重的改變。以往，人們根據環境氣候條件、蟲群基數及食物等來預測預報害蟲的發生，但是高溫條件改變了昆蟲的生存狀況，導致在昆蟲預測報中信息偏差而不準確。不同種類的昆蟲對高溫脅迫的耐受性表現出高低不同，有些昆蟲在高于正常生長溫度較多的條件下仍能正常生存，而有些昆蟲則對溫度的變化極其敏感，較小范圍的溫度波動就可能對其產生較大的影響甚至死亡。

褐飛虱Brown?rice?planthopper(Nilaparvata?lugens(Stal))，別名：褐稻虱，屬同翅目飛虱科(Homoptera:Delphacidae)具遠距離遷飛習性，是我國和許多亞洲國家當前水稻上的首要害蟲，每年造成的農業損失達數億元。該害蟲的預測預報與綜合防治在生產中尤其重要。目前，在全球氣候變暖的大背景下，極端高溫天氣頻繁出現，這給農業上預測預報該害蟲發生情況造成了很大影響。研究褐飛虱對高溫的耐受性及其機理的影響已迫在眉睫。

已有研究結果表明，有機體對外界環境刺激的反應同體內功能基因翻譯、轉錄和表達密切相關，昆蟲對高溫脅迫反應也不例外。高溫對于昆蟲的具體影響從表觀上觀察還無從得知，因此，研究高溫對昆蟲體內遺傳基因的影響是人們了解昆蟲應對脅迫機理機制的一個很好的方法。

研究褐飛虱高溫脅迫后體內相關響應基因種類及其功能，其中重要的技術方法就是對功能基因進行快速、準確的表達定量分析。與傳統的印跡雜交、生物芯片、和半定量RT-PCR等定量分析方法相比，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術具有快速、準確、易操作和低成本等優勢，是近年發展起來的研究基因功能的重要方法。然而，實時熒光定量PCR檢測的準確性中一個最重要的依賴參數是合適的內參基因選擇問題，穩定的內參基因可以對數據進行校正和標準化，從而精確定量目標基因的表達量。內參基因是生物體或者細胞中穩定表達的基因，在不同細胞、組織中表達量幾乎不變，沒有組織特異性，對外界環境刺激反應不敏感。在昆蟲中常用的內參基因有Actin、18S?rRNA、28S?rRNA、GAPDH、Tublin等，但是沒有一種內參基因mRNA表達水平在所有的條件下是一成不變的。在各種因素影響下，如在實驗條件下，細胞發育的不同階段，內參基因的表達水平是不同的。因此，研究不同的環境條件下，某一有機體內基因的表達情況，內參基因的選擇至關重要。

近年來，科研工作者們已經發現一些與昆蟲熱脅迫響應相關的基因，如熱激蛋白基因，褐飛虱體內也已經發現了兩種hsp70和hsp90(Genebank獲取號：JQ782193.1和GU723300.1)，但這些基因在褐飛虱體內對熱脅迫的功能和特征還未進行研究，熱脅迫下褐飛虱體內最穩定的內參基因的研究更未見報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種高溫脅迫下褐飛虱內參基因的篩選方法及應用，為褐飛虱在不同高溫脅迫下合適的內參基因選擇提供依據。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

高溫脅迫下褐飛虱內參基因的篩選方法，以25℃飼養的褐飛虱為對照，設置6個高溫梯度對褐飛虱成蟲進行脅迫處理，處理后立即提取總RNA，反轉錄合成cDNA，然后以對照和各處理為材料進行實時熒光定量PCR驗證，采用geNorm和BestKeeper軟件進行數據分析，從而篩選出褐飛虱成蟲體內不同高溫脅迫和非脅迫(對照)下最穩定表達的內參基因。

上述高溫脅迫下褐飛虱內參基因的篩選方法，包括以下步驟：

<1>采用primer5.0軟件設計合成褐飛虱actin1、actin2、actin3、18S、28S和α-2-Tublin候選內參基因及熱激蛋白hsp90基因特異性實時熒光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲線法確定其擴增特異性及按10倍梯度稀釋cDNA分別進行定量PCR建立標準曲線，確立每對引物的擴增效率；

<2>分別選取30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃高溫脅迫1小時和2小時及非脅迫處理的褐飛虱雌、雄成蟲為實驗材料，提取總RNA，分別反轉錄合成cDNA進行實時熒光定量PCR分析；