[發明專利]一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法

有效

• 申請號: 201410255847.4
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN103983598A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 劉源才;賴富麗;熊瑜;馮聲寶
• 申請（專利權）人: 勁牌有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 黃石市三益專利商標事務所 42109
• 代理人: 瞿暉

技術領域

本發明涉及一種高通量篩選活性物質的方法，具體是一種具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。

背景技術

中國是一個具有深厚酒文化底蘊的國家，大小喜事、聚會以及各種節日都離不開酒。但過量飲酒給人類健康和社會治安造成危害的報道已屢見不鮮。傳統中藥用于解酒有悠久的歷史，目前，我國常用中藥材達幾百種，如何從常用中藥材中尋找具有一定解酒功效的中藥，并將其開發成具有解酒功效，安全方便的藥物或保健品，使醉酒者服用后可快速起效，已成為相關行業開發解酒產品的主要途徑。現在常規的篩選方法一次只能篩選一種中藥，耗時長，試劑用量大，不能滿足企業產品開發的需求。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高效、快捷、簡便的具有解酒功效的中藥材及活性因子的高通量篩選方法。

本發明采用的技術方案包括下述步驟：

a.?將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至20～100目，分別用30%～90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；或將待篩選的若干活性因子分別用30%～90%乙醇、甲醇或丙酮中的一種提取40-60分鐘，離心分離，得若干上清液；此上清液即作為待測樣本溶液；

b.?在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系：50-200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸鉀緩沖液75-90μL,0.1～0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10-15μL,0.1～2mg/ml乙醛脫氫酶20-25μL,0.0625～20mmol/L??NAD+溶液30μL；

c.?再在上述其中一個微孔中加入90?mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號；然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后，迅速在每孔中加入0.04～0.2?mmol/L的乙醛溶液15μL，搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值；

d.?利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net?AUC值，此值即為激活率；激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負數時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。

本發明的優選方法包括下述步驟：

a.將待篩選的若干種中藥材分別粉碎至100目，分別用70%乙醇提取60分鐘，離心分離，得若干上清液；或將待篩選的若干活性因子分別用70%乙醇溶解，離心分離，得若干上清液；上述所得的上清液即作為待測樣本溶液；

b.在微孔板中的每個微孔中加入下述反應體系：100mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖液90μL,?0.5mmol/L的二硫蘇糖醇10μL,1mg/ml乙醛脫氫酶25μL,10mmol/LNAD+溶液30μL；

c.再在上述其中一個微孔中加入90?mmol/L、pH8.5的磷酸鉀緩沖溶液25μL作為空白對照樣品，余下微孔中一一加入各待測樣本溶液25μL作為待測樣品并編號；然后一起置于酶標儀中震蕩孵育30min后，迅速在每孔中加入0.1mmol/L的乙醛溶液15μL，搖勻后立即開始測定各樣品在340nm處的吸光值；

d.利用酶標儀自帶軟件記錄吸光度值并繪制出空白對照樣品及待測樣品吸光度值變化曲線；將所得到的待測樣品曲線的積分面積減去空白對照樣品的曲線積分面積，得出待測樣品曲線凈面積Net?AUC值，此值即為激活率；激活率為正數時證明該樣品中所加入的中藥材或活性因子具有激活乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率為負數時，說明該樣品中所加入的中藥材或活性因子不具備激活或具有抑制乙醛脫氫酶的能力，也說明該藥材或活性因子不具有解酒的功效。

本發明中所述的活性因子是單體化合物或復合物。

本發明的方法是基于以下原理來實現的：乙醇（酒精）通過胃和腸道吸收進入人體血液循環，然后再進行代謝分解，乙醇氧化成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶和NAD+（氧化態輔酶I）作用下，氧化成乙酸，同時NAD+還原成NADH（還原態輔酶I），而NADH在340nm處有吸收而其他反應物在此波長下均無吸收。利用酶標儀測定此波長下生成物吸光度的大小及變化，即可以預測加入物質對乙醛脫氫酶（ALDH）的作用，從而篩選得到具有解酒功效的中藥材及活性因子。