[發明專利]一種來自淀粉酶產色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410255789.5
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104726471A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 王麗娟;姚泉洪;王榮談;彭日荷;李大偉;嚴培蘭;丁衛星;朱波;高建杰;王波
• 申請（專利權）人: 上海瑞豐農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/06;C12N15/10;C12Q1/26
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種來自淀粉酶產色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應用。

背景技術

L-谷氨酸氧化酶(LGOX)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶類，能專一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸、氨和過氧化氫，通過過氧化氫含量的變化可以方便地測定谷氨酸的含量，利用L-谷氨酸氧化酶研制出谷氨酸檢測試劑盒和生物傳感器，在食品工業和臨床生化檢測領域有著廣泛的應用(李玲等.L-谷氨酸氧化酶的分離純化及酶學性質的研究.中國釀造.2012，31(1)：140-143)。

1983年，Kusakabe等從一株鏈霉菌X-119-6(Streptomyces?sp.X-119-6)菌株中分離出底物特異性的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物的Km值僅為0.2mM，該酶耐熱性較強，除催化L-谷氨酸氧化外，僅對L-天冬氨酸有微弱的催化作用(Kusakabe?H?et?al.Purification?and?purification?of?a?new?enzyme，l-glutamate?oxidase，from?Streptomycessp.X-119-6grown?on?wheat?bran.Agric?Biol?Chem.1983，47：1323-1328)，2006年日本Yamasa公司構建了鏈霉菌X-119-6基因組文庫，通過探針篩選獲得了LGOX基因，該基因長2103bp，編碼701個氨基酸，含有14個信號肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、γ三個亞基組成，一般組成二聚體形式，分子量大約為140KDa。他們構建大腸桿菌強啟動子調控LGOX基因表達的載體，轉化到大腸桿菌中，實現了LGOX前體蛋白在大腸桿菌的高效表達，表達的前體蛋白經過內切蛋白酶處理后可以變成活性蛋白(US?patent7109008)。目前該產品轉由Kikkoman公司生產并壟斷了市場。

由于LGOX生產被國外企業控制，我國在上述領域研究相對滯后，而至今所篩選到的L-谷氨酸氧化酶產生菌的產酶能力大多很低，即使經過誘變，產酶能力也不高，因此獲得新型LGOX基因并實現基因工程化生產成為解決該酶來源的根本途徑。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種來自淀粉酶產色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應用，利用基因合成法制備淀粉酶產色鏈霉菌L-谷氨酸氧化酶基因，并對該基因進行表達和酶的底物譜分析，以證明其能特異性催化L-谷氨酸，具有作為L-谷氨酸含量檢測用酶的前景。

本發明是通過如下技術方案實現的：

所述的來自淀粉酶產色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1，其編碼的蛋白質序列如SEQ?ID?No.2。

所述的淀粉酶產色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的獲取方法如下：

利用含50ppm重鉻酸鉀的高氏一號培養基(高氏一號培養基：可溶性淀粉20g/L，KNO₃lg/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，NaCl0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，瓊脂20g/L，pH＝7.4)，從土壤微生物中篩選產L-谷氨酸氧化酶的菌株，菌株在顯色液(0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，0.07％的4-氨基安替吡啉，0.8％的L-谷氨酸，0.1％的苯酚，2000U/L的辣根過氧化物酶)中顯紅色即為產L-谷氨酸氧化酶。

將篩選得到的菌落提取總DNA，根據L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列設計引物

Primer?A：5’-AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3’和Primer?B：

5’-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3’為擴增引物，以總DNA為模板，獲得一段984bp的PCR片段。以此序列為基礎，采用Genome?Walking?Kit試劑盒(大連寶生物公司)獲取其兩側的未知序列，查找完整的開放閱讀框，從而獲得該L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。

所述的堿基序列如序列表中SEQ?ID?No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通過化學合成方法得到。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行全基因的合成(PTDS)(Nucleic?Acids?Research，2004，32：e98)。

具體合成方法包括以下步驟：