[發明專利]豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體檢測用引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201410253400.3
• 申請日: 2014-06-09
• 公開（公告）號: CN104004847B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 付媛;石團員;方維煥;徐麗華;袁秀芳;李軍星;盧福莊;張雪娟;舒琦艷;魏巍;周永學
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體檢測用引物及檢測試劑盒。

背景技術

豬的附紅細胞體病主要引起仔豬發熱、貧血蒼白、黃疸和母豬流產等癥狀，常與其他豬病混合感染危害嚴重，防治十分困難。近年來研究表明感染豬的附紅細胞體的種類有兩種，豬附紅細胞體(Mycoplasma?suis?MS)和小附紅細胞體(Mycoplasma?parvum?MP)，原來歸于立克茲氏體目質體科，近年來根據16Sr?RNA基因的序列分析和電鏡的觀察結果，將附紅細胞體劃分到支原體屬的嗜血支原體。我們在附紅細胞體感染的豬體內分離到第三種感染豬的新附紅細胞體病原，并在Genbank上公布了其16S?rRNA和rnpB基因序列(登錄號JX489600和JX489603)，暫定名為未定種附紅細胞體(Candidate?mycoplasma?haemosuis?CMH)。由于嗜血支原體都不能夠純培養，對其研究造成很大的困難。目前臨床上主要依靠顯微鏡檢查鮮血壓片和姬姆薩染色片進行診斷，這些方法存在滯后性和顯著的假陽性，實驗室診斷方法有檢測抗體的酶聯免疫吸附法(ELISA)和檢測病原的聚合酶鏈式反應(PCR)診斷方法，但現有的診斷方法主要針對的病原為豬附紅細胞體MS，對其他兩種病原體MP和CMH的診斷方法尚未有報道。同時根據我們的臨床調查發現，在我國浙江上海安徽等地區感染豬的附紅細胞體種類主要為MP而并非國內外研究較多的MS。為了能夠明確這類病原的致病性和致病機理，亟需可以診斷三種病原的診斷方法。

本發明首次將PCR技術應用于同時檢測豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體檢測領域，提供了針對豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體檢測的特異性引物、試劑盒和檢測方法。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的同時檢測豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體的核苷酸序列。

本發明要解決的第二個技術問題是提供快速、準確、使用方便的同時檢測豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體的檢測試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了檢測豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體檢測引物，具體如下：

通過序列比較分析，根據豬附紅細胞體ZJ?NB01株16Sr?RNA基因序列(GenBank登錄號：KC907396)保守區199-582位置和小附紅細胞體ZJ?JX9330株16Sr?RNA基因序列(GenBank登錄號：HQ489599)保守區198-581位置設計一對通用引物：

1)MP和MS正義引物(MF)

5'TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3'(SEQ?ID?NO：1)；

2)MP和MS反義引物(MR)

5'TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3'(SEQ?ID?NO：2)；

其中，M代表兼并堿基A或C；

擴增目的片段為384bp，擴增到MS序列如序列表SEQ?ID?NO：5所示；

其中，21bp處M代表兼并堿基A或C。

擴增到MP序列如序列表SEQ?ID?NO：6所示；

通過序列比較，根據未定種附紅細胞體CMH已公布的ZJ?SXSY1102株16Sr?RNA基因序列(GenBank：JX489600)，在其保守區441-972位置設計一對引物：

3)CMH正義引物(CMHF)

5’AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’(SEQ?ID?NO：3)；

4)CMH反義引物(CMHR)

5’CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’(SEQ?ID?NO：4)；

擴增目的基因大小為532bp，序列如序列表SEQ?ID?NO：7所示；

其中，490bp處M代表兼并堿基A或C。

本發明還提供了一種豬附紅細胞體、小附紅細胞體和未定種附紅細胞體的檢測試劑盒，由以下組分組成：

1)DNA提取試劑；通常可以使用商業購買的血液DNA提取試劑盒，例如杭州新景生物技術開發有限公司的全血DNA提取試劑盒(Blood?DNA?Mini?kit，Cat.No.3001050)；

2)DNA標準品：含豬附紅細胞體靶基因的T載體質粒和含未定種附紅細胞體靶基因的T載體質粒；