[發明專利]12F型肺炎球菌單克隆抗體及其應用

在審

• 申請號: 201410250302.4
• 申請日: 2014-06-06
• 公開（公告）號: CN104140956A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 陳磊;王欣;童欽;李育榮;王琳;蔡芳;高強;尹衛東
• 申請（專利權）人: 北京科興中維生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及免疫學檢測領域，具體地說，涉及12F型肺炎球菌單克隆抗體及其應用。?

背景技術

肺炎抗體是指動物抗肺炎球菌各型別莢膜多糖產生的的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應用于肺炎鏈球菌菌株鑒定、肺炎多糖疫苗以及肺炎結合疫苗中各型別多糖的定性和定量檢測。?

目前世界上廣泛應用的肺炎抗體主要來自兔血清。丹麥血清研究所(SSI)使用各型別肺炎球菌靜脈注射兔子，制備兔抗各型肺炎莢膜多糖的血清，應用于肺炎球菌菌種鑒定以及肺炎莢膜多糖含量測定等實驗。由于肺炎莢膜多糖成分復雜，許多型別之間存在交叉反應(如6A和6B，19A和19F等)，使用此方法制備的肺炎多糖抗體為多抗的混合物，特異性差，不同型別之間存在交叉反應，只有通過多次菌體吸附，才能降低交叉作用的發生，因而給鑒定工作帶來不必要的麻煩，同時增加了實驗誤差，此外，該方法制備的抗體水平較低，抗體滴度小，抗體效價不高，穩定性差，易降解，為抗體的長久保存帶來困難。因此，制備出特異性好、抗體滴度高且穩定性好的肺炎多糖抗體成為了亟待解決的問題。?

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種特異性好、抗體水平高且能長期保存的12F型肺炎球菌單克隆抗體。?

為了實現本發明目的，本發明通過將免疫肺炎多糖原液的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，分離出能夠分泌肺炎抗體的單克隆雜交瘤細胞，接種小鼠腹腔，制備含有特異性肺炎抗體的腹水，經過后期處理?并驗證，得到一種特異性好、抗體水平高且能長期保存的肺炎抗體。?

本發明首先提供了一種肺炎12F型單抗雜交瘤細胞株Sino12F。該雜交瘤細胞株現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC?No.9235，保藏日期2014年5月26日。?

本發明還提供了由上述雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。?

具體而言，本發明采用小鼠骨髓瘤細胞雜交瘤技術制備12F型肺炎球菌單克隆抗體，包括如下步驟：?

1)動物免疫?

12F型肺炎球菌多糖原液與弗氏完全佐劑等體積混合后進行乳化背部皮下注射小鼠，后與弗氏不完全佐劑等體積混合后乳化進行第二次和第三次免疫，若第三次免疫后，抗體效價經ELISA方法檢測抗體滴度在10000以上，則認為合格，腹腔注射12F型肺炎多糖原液進行加強免疫，不用乳化，劑量與前三次相同。?

2)脾細胞融合?

將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按一定比例混合，37℃水浴融合。將PEG滴入混合系中；緩慢加入無血清的IMDM培養基，離心棄去上清后加入IMDM完全培養液，將混懸液分別加至96孔細胞培養板中，CO2培養箱內培養后，添加HAT培養液。?

3)雜交瘤細胞長至一定程度時進行抗體ELISA檢測，及時做亞克隆。將HT培養基稀釋的雜交瘤細胞加入96孔板培養。培養兩周后將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養，并凍存。?

4)凍存的單克隆細胞進行復蘇，培養，25ml的細胞培養瓶細胞覆蓋瓶底70％-80％時進行腹腔接種Balb/c雌性小鼠，定期收集腹水。?

進一步地，本發明還提供了包括上述單克隆抗體的試劑盒，用于檢測肺炎球菌12F型多糖。?

進一步地，所述單克隆抗體經生物標記或化學標記。?

作為優選，所述標記為酶標記。?

更為優選，所述標記為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記。?

本發明還提供了所述單克隆抗體在檢測肺炎多糖疫苗中12F型多糖含量中的應用。?

作為優選，所述單克隆抗體經生物標記或化學標記。?

本發明采用12F型多糖原液免疫小鼠，制備小鼠脾細胞并與骨髓瘤細胞進行融合，制備能夠分泌12F型單克隆抗體的單克隆細胞株，腹腔接種小鼠制備12F型單抗腹水。?

本發明的有益效果在于：?

1、使用12F型肺炎多糖原液與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，與菌體免疫相比具有較好的特異性。?

2、篩選雜交瘤細胞時，除用12F型多糖檢測細胞上清為陽性外，還用CPS多糖檢測細胞上清為陰性，確保雜交瘤細胞分泌的抗體只是針對12F型多糖，不含抗CPS多糖的抗體。?

3、制備的12F型單抗腹水經過驗證后，可以用于速率免疫濁度法檢測12F型多糖含量、雙抗體夾心法檢測肺炎多糖含量，以及進行酶標記之后制備酶標二抗。?