[發明專利]利用Bacillus subtilis NAD+再生系統高效生物轉化2,3-丁二醇生產乙偶姻

無效

• 申請號: 201410249908.6
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN104017764A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 包騰;饒志明;張顯;趙曉靜;楊套偉;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P7/26;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種加強輔酶循環再生的重組枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，其特征在于：將SEQ?ID?NO：1所示的乙偶姻還原酶基因bdhA和SEQ?ID?NO：2所示的NADH氧化酶基因yodC共同克隆到穿梭載體pMA5構建成為重組穿梭表達質粒pMA5-bdhA-yodC并轉化至保藏編號為CCTCC?NO：M209309的枯草芽孢桿菌B.subtilis?JNA中，從而提高枯草芽孢桿菌利用2，3-丁二醇全細胞轉化生產乙偶姻的能力。

2.利用權利要求1構建的重組枯草芽孢桿菌B.subtilisJNA/pMA5-bdhA-yodC，優化其全細胞轉化反應條件，其特征為：反應最適pH為8.0；反應最適溫度為40℃；最適反應底物2,3-丁二醇濃度為40g/L；5mM?MnCl₂對反應有明顯促進作用。

3.在權利要求2全細胞轉化反應條件下，利用權利要求1構建的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis?JNA/pMA5-bdhA-yodC，全細胞轉化2,3-丁二醇生產乙偶姻的應用，其特征是：菌株B.subtilis?JNA/pMA5-bdhA-yodC接種于含卡那霉素10mL?LB培養基中，37℃振蕩培養7-9h后，取1ml轉接于3瓶50ml含40g/L葡萄糖的LB培養基中37℃振蕩培養，當培養至OD₆₀₀＝5.0-6.0時，加入1.85L發酵培養基(該發酵培養基的配方為：大豆蛋白胨1g/L，葡萄糖4g/L，玉米漿1.5g/L，尿素0.3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀0.17g/L，磷酸二氫鉀0.23g/L，硫酸錳0.075g/L，去離子水配置，pH6.5)的5L發酵反應器中培養36h，10000rpm離心10min收集菌體，加入含2L反應體系(2,3-丁二醇40g/L，MnCl₂5mM，pH8.0，反應溫度40℃，)的5L反應器中，當底物2,3-丁二醇僅剩約10g/L時，收集反應液10000rpm離心10min收集菌體，重新轉化，直至反應速率明顯下降，最終同一批菌株，經過3次全細胞轉化后，120g/L2,3-丁二醇轉化為約92.5g/L乙偶姻，產率達到2.31g/(L·h)，為國內外首次通過NAD⁺再生系統在野生型高產乙偶姻枯草芽孢桿菌中利用2,3-丁二醇高效轉化生產乙偶姻，最終實現提高轉化速率、高效生產乙偶姻的目的。