[發明專利]主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構建方法

有效

• 申請號: 201410248884.2
• 申請日: 2014-06-07
• 公開（公告）號: CN104001168A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 馬雁冰;龍瓊;黃惟巍;姚宇峰;楊旭;孫文佳;金曉媚;李楊;褚曉杰;劉存寶
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: A61K39/385
• 分類號: A61K39/385;A61K38/20;A61K47/42;A61P11/06
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

1.一種主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1）、從小鼠提取IL-33總RNA，通過逆轉錄得到IL-33總cDNA，用設計的特異性引物將得到的總cDNA通過PCR擴增，得到編碼IL-33成熟片段基因，所述特異性引物設計如下：

編碼IL-33成熟片段基因的上游引物(5’端)：gtggatccagcatccaaggaacttcac

編碼IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端)：gtgaattcgattttcgagagcttaaac

2）、將編碼截斷的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA載體，再將步驟1）得到的編碼IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之間，得到重組質粒pHBcAg33；

3）、將步驟2）得到的重組質粒pHBcAg33轉化大腸桿菌DH5α或BL21感受態細胞上；

4）、用IPTG誘導步驟3）的轉化有重組質粒pHBcAg33的大腸桿菌DH5α或BL21，高效表達IL-33目的蛋白，并用飽和度為40%和30%的硫酸銨、體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，對IL-33目的蛋白進行密度梯度離心純化，最后用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化IL-33目的蛋白，得到呈遞IL-33的病毒樣顆粒疫苗。

2.如權利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構建方法，其特征在于所述步驟2）的重組質粒構建如下：

編碼截斷的HBcAg基因由專業公司合成，其中5’端和3’端分別有BamH?I?和?EcoR?I的酶切位點，并用內切酶Nde?I和Pst?I酶切后克隆到pThioHisA中，得到質粒pHBcAg；然后再用BamH?I?和?EcoR?I將編碼IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到帶有目的蛋白的重組質粒pHBcAg33。

3.如權利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構建方法，其特征在于所述步驟4）中的目的蛋白的誘導和純化經過下列步驟：

1）將25℃下IPTG誘導4小時的1升菌液離心后，收集菌體；

2）用0.02?摩爾/升、pH?7.4的磷酸緩沖液20毫升，將步驟1）收集的菌體重新懸起來，用超聲波破碎菌體后離心分離，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸銨，室溫下放置30分鐘后離心，收集沉淀，所述硫酸銨在25℃條件下達到的飽和度為40%；再用20毫升飽和度為30%的硫酸銨溶液洗滌收集的沉淀，共洗滌三次；最后用0.02?摩爾/升、pH?7.4的磷酸緩沖液溶解洗滌后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通過體積比為27%、33%和39%的碘克沙醇進行密度梯度離心，具體操作為；從5毫升離心管的底部到頂部依次加入1.4毫升體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每個體積比的碘克沙醇之間形成明顯界限，室溫放置過夜；次日每個體積比的碘克沙醇之間的界限消失，向離心管中加入700微升磷酸緩沖液溶解樣品，在16℃，50000轉/分鐘條件下，離心4小時；之后每200微升取一次樣品，經聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，將目的蛋白較多的樣品用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化，得到呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗。

4.如權利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構建方法，其特征在于所述步驟4）得到的呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗用于主動免疫治療哮喘。