[發(fā)明專利]一種檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410248075.1
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN104007268A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 混旭;柏莉;徐亞瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)與生物傳感器領(lǐng)域，具體為一種檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及所述的生物傳感器檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的方法。?

背景技術(shù)

腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的過程是腫瘤細(xì)胞與宿主相互作用的多環(huán)節(jié)過程。腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種蛋白水解酶參與降解細(xì)胞外基質(zhì)。基質(zhì)金屬蛋白酶是其中的主要酶類，基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，因其需要Ca²⁺、Zn²⁺等金屬離子作為輔助因子而得名。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)除可以降解Ⅳ型膠原外，還能降解Ⅴ、Ⅶ型膠原及明膠，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。近年來，MMP-2的結(jié)構(gòu)和功能得到了廣泛、深入的研究。很多研究結(jié)果表明，MMP-2在多種疾病的病理進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。一些研究者根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，通過檢測MMP-2可以估計(jì)這些疾病的病理進(jìn)程，也就是MMP-2可以作為這些疾病的預(yù)后指標(biāo)。據(jù)此，研制準(zhǔn)確、靈敏、快速測定MMP-2、MMP-7活性的方法具有極高的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。?

基質(zhì)金屬蛋白酶常用測定方法有酶聯(lián)免疫吸附法(Patel,S.；Sumitra,G.；Koner,B.C.；Saxena,A.Clin.Biochem.2011,44,869-872)；表面等離子共振法(Pieper-Fürst,U.；Kleuser,U.；?W.F.M.；Warsinke,A.；Scheller,F.W.Anal.Biochem.2004,332,160-167)；凝膠電泳法(Barbosa,F?Jr.；Gerlach,R.F.；Tanus-Santos,J.E.Basic?Clin.Pharmacol.Toxicol.2006,98,559-564.Yamane,T.；Mitsumata,M.；Yamaguchi,N.；Nakazawa,T.；Mochizuki,K.；Kondo,T.；Kawasaki,T.；Murata,S.；Yoshida,Y.；Katoh,R.Cell?Tissue?Res.2010,340,471-479)；熒光法(Lefkowitz,R.B.；Schmid-G.W.；Heller,M.J.Anal.Chem.2010,82,8251-8258)；酶切割超磁性法(Zhao,M.；Josephson,L.；Tang,Y.；Weissleder,R.Angew.Chem.,Int.Ed.2003,42,1375-1378)；磁共振成像法(Harris,T.J.；von?Maltzahn,G.；Derfus,A.M.；Ruoslahti,E.；Bhatia,S.N.Angew.Chem.,Int.Ed.2006,45,3161-3165)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Wang,Y.H.；Shen,P.；Li,C.Y.；Wang,Y.Y.；Liu,Z.H.Anal.Chem.2012,84,1466-1473)等。這些方法各有其優(yōu)點(diǎn)，能不同程度的滿足對基質(zhì)金屬蛋白酶-2的檢測要求，但方法復(fù)雜，需要貴重的儀器，檢測成本高。所以必須發(fā)展一種方法簡單、成本低廉的新型檢測方法。?

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法及應(yīng)用，以及提供一種采用所述的生物傳感器檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的方法。?

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：?

一種檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：?

(1)將100μL0.1～10μM肽溶液加到膠體金修飾的96孔板中，37℃反應(yīng)12～60h，用Tris-HCl溶液沖洗各孔，得肽修飾膠體金-96孔板；?

(2)加10μL0.1～2mg/mL鏈霉親和素溶液于轉(zhuǎn)化酶-AuNPs(轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金)溶液中，置于恒溫振蕩器上震蕩4～32h。然后以8000～14000轉(zhuǎn)速下離心，將沉淀加1mL?Tris-HCl溶液分散，得鏈霉親和素修飾轉(zhuǎn)化酶膠體金(streptavidin-轉(zhuǎn)化酶-AuNPs)；?

(3)取streptavidin-轉(zhuǎn)化酶-AuNPs溶液加到肽修飾膠體金-96孔板中反應(yīng)，之后用Tris-HCl溶液沖洗各孔，從而得基質(zhì)金屬蛋白酶-2生物傳感器；?

其中：所述的膠體金修飾的96孔板按如下的方法制備而成：96孔板用無水乙醇和水依次超聲處理3次，然后在37℃下干燥。將100μL膠體金溶液滴涂在處理好的96孔板中，在室溫條件下使溶劑自然揮發(fā)，即得膠體金修飾96孔板(膠體金-96孔板)；?