[發明專利]蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法

有效

• 申請號: 201410247111.2
• 申請日: 2014-06-06
• 公開（公告）號: CN104120191A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 李云峰;蔡鵬;龍川鳳;趙亮;葛藤
• 申請（專利權）人: 李云峰
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 大連科技專利代理有限責任公司 21119
• 代理人: 龍鋒

1.蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)?設計引物并對下游引物進行生物素標記，在引物特異性驗證成功后，進行蟲媒病毒多重PCR擴增，其中所述蟲媒病毒為基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亞-?剛果出血病毒CCHFV和裂谷熱病毒RVFV三種，其中多重PCR擴增反應體系為：?

反應條件為：95?℃，10?min；94?℃，30?s，55?℃，30?s，72?℃，30?s，35?cycles；72?℃，10?min；4℃，hold；所述混合引物為上下游引物的混合物，上下游引物的濃度比為1:1-1:8；反應體系中所述模板可以為模板1、2、3種的任意一種或任意兩種組合或三種；

2)?設計核酸探針并進行氨基化修飾，與熒光編碼微球偶聯制得微球混合液；

3)?設計偶聯質控探針并加入到步驟2）得到的微球混合液進行偶聯質量控制，所述偶聯質控探針序列與步驟2）所述核酸探針序列互補；

4)?將PCR產物與微球混合液進行雜交反應，同時加入用核酸檢測緩沖液稀釋的鏈霉素-藻紅蛋白，并通過液相芯片檢測儀對反應產物進行分析。

2.根據權利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述基孔肯雅病毒CHIKV、裂谷熱病毒RVFV和克里米亞-剛果出血熱CCHF的引物序列為：

。

3.根據權利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述上下游引物的濃度比為1:8。

4.根據權利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述核酸探針和偶聯質控探針的序列為：

。

5.根據權利要求4所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述序列中每個核酸探針的5^’端加10個poly(T)，再加氨基修飾，并對偶聯質控探針的5^‘端進行了生物素標記。

6.根據權利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，步驟2）所述偶聯微球混合液通過如下步驟制得：

1)?隨機選取帶有不同編號的羧基化微球并活化；

2)?向活化微球中各加入100?pmol/μL的氨基化修飾的核酸探針3-5?μL，瞬時震蕩；

3)?再各加3?μL核酸偶聯活化劑，即10?mg/mL?的EDC到上述微球中，瞬時震蕩；

4)?室溫避光孵育30-45min；

5)?向上述微球中各加200?μL核酸偶聯洗滌液A?，即0.02%?吐溫-20，全速震蕩5min；

6)?12，000×g?離心微球10min；

7)?棄上清，向上述微球中加入200μL核酸偶聯洗滌液B，即0.1%?SDS，全速震蕩5min；

8)?12，000×g?離心微球10min；

9)?棄上清，不要觸動沉淀；

10)?各加入100μL?核酸偶聯微球貯存液，全速震蕩或超聲波懸浮微球5min制得偶聯微球混合液。

7.根據權利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，步驟3）偶聯質量控制包括如下步驟：

1)?取偶聯混合微球5μL，加入到1.5?mL離心管中，并用核酸檢測緩沖液1，?即1.5×TMAC，稀釋至33μL；

2)?將偶聯質控探針稀釋至0.01μM的混合液，取7μL偶聯質控探針混合液，加入到含上述33μL微球混合液的1.5mL離心管中；

3)?然后用核酸檢測緩沖液2?，即1.0×TMAC，補足體積至50μL，52℃避光孵育15min；

4)?加入25μL?的10μg/mL?SAPE，混勻，52℃避光孵育5min，加入反應終止液50μL；

5）??液相芯片系統中進行測試，判斷標準：空白質控熒光信號中值小于100，偶聯質控熒光信號中值大于1000。