[發明專利]單酶切載體的構建方法

有效

• 申請號: 201410246859.0
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN104059932A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 劉國世;何長久;朱寬峰;孔瑾;汪鋒;田秀芝;宋玉坤
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種單酶切載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)單酶切位點的篩選；

2)在目的基因兩端引入酶切位點；

3)對載體和目的基因進行酶切和電泳切膠回收；

4)對目的基因和載體混合液進行溫度梯度預處理；

5)使用連接T載體用的solution I連接載體與目的基因。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟2)在目的基因的5’和3’端非編碼區設計擴增引物，在上下游引物的5’端引入步驟1)確定的酶切位點，加上酶切位點相應的保護堿基，利用高保真酶擴增目的基因，擴增出5’和3’端含有相應的酶切位點的目的基因。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟4)載體與目的基因按物質量濃度1：10的比例加入。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，步驟4)載體和目的基因混合液按以下程序處理：

80℃：3min；

55℃：15s；

45℃：15s；

16℃：30s；

在16℃30s結束后再加入solution I，在16℃下連接90min。

5.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，步驟4)連接反應總體系為15-20μL。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，目的基因與載體連接后，還包括如下步驟：

A、轉化感受態細胞；

B、菌液涂板培養；

C、挑斑培養；

D、菌落PCR鑒定。