[發明專利]一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201410246788.4
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104017077A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 吳曉東;張永強;趙永剛;李金明;王志亮
• 申請（專利權）人: 中國動物衛生與流行病學中心
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
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技術領域

本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用。

背景技術

傳染性海綿狀腦病(Transmissible?Spongiform?Encephalopathies，TSE)，又稱朊毒體病，是感染人和動物中樞神經系統的一類慢性、退化性、致死性疾病。引起TSE的蛋白質稱為朊蛋白(Prion)，分為細胞型(PrPC)和致病型(PrPSc)。

TSE是由于PrPC轉變成PrPSc所致。該病除了可以在物種內傳播外，目前已知羊癢病病原PrPSc可誘導牛的PrPC轉變為PrPSc，引起瘋牛病；牛的PrPSc可以誘導人的PrPC轉變為PrPSc，引起人的新型克雅氏癥，但是該病的跨物種傳播以及PrPC和PrPSc之間的轉變機制并不清楚，朊蛋白的特異性單抗在該病的研究中發揮了重要的作用。例如，Brun等制備的單抗2A11能檢測到IHC中PK酶(Protease?K)消化后的PrP27-30，但檢測不到未經PK酶消化的PrPSc和正常牛腦切片中的PrPC，揭示了2A11的結合位點位于PrPSc和PrPC內部，經PK酶消化后暴露在了PrPSc表面，該發現對于朊蛋白高級結構的研究具有促進作用。

本發明創作者利用發明的方法制備了一株能鑒別牛羊朊蛋白的單克隆抗體并進行了應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應用，用以進行研究朊蛋白研究。

為實現上述目的，本發明提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，該具體過程為：

步驟a，準備用于免疫和篩選的朊蛋白抗原；

步驟b，骨髓瘤細胞SP2/0的準備；

步驟c，動物免疫與細胞融合；

步驟d，陽性雜交瘤細胞的篩選與腹水單抗制備；

步驟e，單抗成份鑒定；

步驟f，單抗應用。

進一步，在上述步驟a中，重組表達牛和羊PrPC核心片段，以羊PrPC核心片段作為用于免疫的朊蛋白抗原。以牛和羊PrPC核心片段作為篩選包被抗原。

進一步，在上述步驟b中，細胞融合前一周復蘇凍存于液氮中的SP2/0，在20％小牛血清HT培養基和5％CO₂培養箱中培養，每天觀察生長狀況，融合前調整至對數生長期。

進一步，在上述步驟c中，將步驟a中制備的羊朊蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，在其腹部皮下多點注射6周齡PrP基因敲除小鼠，20μg/只；2周后腹部皮下多點注射相同劑量弗氏不完全佐劑充分乳化的朊蛋白抗原；14d后腹腔追加注射5μg朊蛋白抗原，3d后無菌取脾臟進行細胞融合。

進一步，在上述步驟d中，采用間接ELISA方法對長有雜交瘤細胞的孔進行篩選，以純化的重組牛和羊PrPC核心片段為包被抗原分別包板；

檢測羊PrPC核心片段為陽性同時牛PrPC核心片段為陰性的孔，進行24孔板擴大培養；檢測仍符合上述條件的孔，采用有限稀釋法進行2次亞克隆；取形態良好，生長旺盛的單克隆細胞6孔板擴大培養，一部分用于液氮凍存，另一部分用于單抗腹水的生產；取青壯年Balb/c小鼠，制備腹水單抗。

進一步，在上述步驟e中，比較牛、羊PrPC核心片段氨基酸序列，找出兩者存在差異的位置，以此位置為中心，人工合成10肽，以16μg/mL分別溶于CBS(pH9.6)，每孔加入100μL溶液，37℃孵育2h，5％脫脂乳4℃封閉過夜；

包被好的ELISA板與所得單抗進行標準ELISA反應，檢測所得單抗的特異性抗原結合位點，所述單克隆抗體的抗原結合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸；比較不同物種該位點的氨基酸，確定所得單抗與哪些物種PrPC核心片段能夠結合，與哪些物種PrPC核心片段不結合。

本發明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體，所述單克隆抗體的抗原結合位點為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，該單抗只與羊PrPC反應，不與牛PrPC反應。

本發明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的應用，取健康牛、羊腦組織勻漿、離心處理后，進行SDS-PAGE電泳并轉印至PVDF膜；5％脫脂奶4℃封閉過夜，TBST洗滌5次，3min/次；加入腹水單抗1.5h，TBST洗滌10次，3min/次；加入生物素標記二抗1h，TBST洗滌6次，3min/次，采用化學發光法進行X底片曝光。