[發(fā)明專利]一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410246788.4
• 申請(qǐng)日: 2014-05-30
• 公開（公告）號(hào): CN104017077A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳曉東;張永強(qiáng);趙永剛;李金明;王志亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳染性海綿狀腦病(Transmissible?Spongiform?Encephalopathies，TSE)，又稱朊毒體病，是感染人和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類慢性、退化性、致死性疾病。引起TSE的蛋白質(zhì)稱為朊蛋白(Prion)，分為細(xì)胞型(PrPC)和致病型(PrPSc)。

TSE是由于PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc所致。該病除了可以在物種內(nèi)傳播外，目前已知羊癢病病原PrPSc可誘導(dǎo)牛的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，引起瘋牛病；牛的PrPSc可以誘導(dǎo)人的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，引起人的新型克雅氏癥，但是該病的跨物種傳播以及PrPC和PrPSc之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制并不清楚，朊蛋白的特異性單抗在該病的研究中發(fā)揮了重要的作用。例如，Brun等制備的單抗2A11能檢測(cè)到IHC中PK酶(Protease?K)消化后的PrP27-30，但檢測(cè)不到未經(jīng)PK酶消化的PrPSc和正常牛腦切片中的PrPC，揭示了2A11的結(jié)合位點(diǎn)位于PrPSc和PrPC內(nèi)部，經(jīng)PK酶消化后暴露在了PrPSc表面，該發(fā)現(xiàn)對(duì)于朊蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究具有促進(jìn)作用。

本發(fā)明創(chuàng)作者利用發(fā)明的方法制備了一株能鑒別牛羊朊蛋白的單克隆抗體并進(jìn)行了應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用，用以進(jìn)行研究朊蛋白研究。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的制備方法，該具體過(guò)程為：

步驟a，準(zhǔn)備用于免疫和篩選的朊蛋白抗原；

步驟b，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的準(zhǔn)備；

步驟c，動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合；

步驟d，陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與腹水單抗制備；

步驟e，單抗成份鑒定；

步驟f，單抗應(yīng)用。

進(jìn)一步，在上述步驟a中，重組表達(dá)牛和羊PrPC核心片段，以羊PrPC核心片段作為用于免疫的朊蛋白抗原。以牛和羊PrPC核心片段作為篩選包被抗原。

進(jìn)一步，在上述步驟b中，細(xì)胞融合前一周復(fù)蘇凍存于液氮中的SP2/0，在20％小牛血清HT培養(yǎng)基和5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察生長(zhǎng)狀況，融合前調(diào)整至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

進(jìn)一步，在上述步驟c中，將步驟a中制備的羊朊蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，在其腹部皮下多點(diǎn)注射6周齡PrP基因敲除小鼠，20μg/只；2周后腹部皮下多點(diǎn)注射相同劑量弗氏不完全佐劑充分乳化的朊蛋白抗原；14d后腹腔追加注射5μg朊蛋白抗原，3d后無(wú)菌取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

進(jìn)一步，在上述步驟d中，采用間接ELISA方法對(duì)長(zhǎng)有雜交瘤細(xì)胞的孔進(jìn)行篩選，以純化的重組牛和羊PrPC核心片段為包被抗原分別包板；

檢測(cè)羊PrPC核心片段為陽(yáng)性同時(shí)牛PrPC核心片段為陰性的孔，進(jìn)行24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)；檢測(cè)仍符合上述條件的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行2次亞克隆；取形態(tài)良好，生長(zhǎng)旺盛的單克隆細(xì)胞6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分用于液氮凍存，另一部分用于單抗腹水的生產(chǎn)；取青壯年Balb/c小鼠，制備腹水單抗。

進(jìn)一步，在上述步驟e中，比較牛、羊PrPC核心片段氨基酸序列，找出兩者存在差異的位置，以此位置為中心，人工合成10肽，以16μg/mL分別溶于CBS(pH9.6)，每孔加入100μL溶液，37℃孵育2h，5％脫脂乳4℃封閉過(guò)夜；

包被好的ELISA板與所得單抗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA反應(yīng)，檢測(cè)所得單抗的特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點(diǎn)羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸；比較不同物種該位點(diǎn)的氨基酸，確定所得單抗與哪些物種PrPC核心片段能夠結(jié)合，與哪些物種PrPC核心片段不結(jié)合。

本發(fā)明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體，所述單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)為羊朊蛋白208位的異亮氨酸，該位點(diǎn)羊朊蛋白為異亮氨酸，牛為甲硫氨酸，該單抗只與羊PrPC反應(yīng)，不與牛PrPC反應(yīng)。

本發(fā)明還提供一種鑒別不同物種朊蛋白單克隆抗體的應(yīng)用，取健康牛、羊腦組織勻漿、離心處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5％脫脂奶4℃封閉過(guò)夜，TBST洗滌5次，3min/次；加入腹水單抗1.5h，TBST洗滌10次，3min/次；加入生物素標(biāo)記二抗1h，TBST洗滌6次，3min/次，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行X底片曝光。