[發(fā)明專利]一種蠟樣芽孢桿菌及其制劑及應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN104694412B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳朱蕾;汪佳;席爽;宮千惠;俞瑛健
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C05F17/00;C05F3/00;C12R1/085
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心42201
• 代理人: 梁鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蠟樣芽孢桿菌、其篩選方法、制劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗生素被廣泛用于我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，并以其本體或轉(zhuǎn)化形態(tài)隨著動(dòng)物糞便和尿液排入環(huán)境，并在環(huán)境中蓄積，造成環(huán)境中抗生素污染。抗生素進(jìn)入環(huán)境后會(huì)破壞環(huán)境中原有微生物種類平衡，從而導(dǎo)致相應(yīng)生態(tài)系統(tǒng)失衡。另外，環(huán)境中的土霉素還可以通過生物鏈進(jìn)入人體，對人體健康造成威脅。為此，我國科技部啟動(dòng)國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)，設(shè)立“集約養(yǎng)殖外源化學(xué)品污染控制技術(shù)”重大專項(xiàng)，主要針對集約養(yǎng)殖場造成的抗生素污染從源頭上進(jìn)行處理。土霉素作為目前使用量最大的獸用抗生素，成為科技攻關(guān)的核心問題。

近年來，殘留抗生素在環(huán)境中的降解、轉(zhuǎn)化、遷移、歸趨和對動(dòng)植物、微生物等影響有關(guān)的研究很多并呈上升趨勢，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，但是有關(guān)如何削減環(huán)境中殘留抗生素的研究目前還比較少見。

目前抗生素污染控制技術(shù)主要包括物理、化學(xué)及生物處理技術(shù)。抗生素的物理去除方法主要有活性炭吸附、膠體吸附、絮凝沉淀以及膜過濾等方法。而抗生素的化學(xué)去除方法現(xiàn)在以離子法為主。由于抗生素的生物降解相對其他物理、化學(xué)方法，具有成本低廉、環(huán)境影響較小的獨(dú)特優(yōu)勢，目前以受到廣泛關(guān)注，而微生物在其中的作用也得到了重點(diǎn)研究。許曉玲等從長期堆放四環(huán)素藥渣的土壤中篩選四環(huán)素降解菌株兩株，分別為缺陷短波單胞菌和人蒼白桿菌。它們均可利用四環(huán)素作為碳源生長。李麗等通過研究最終找到一種對氯嘧磺隆10mg/L的降解率為94.78％細(xì)菌。

土霉素作為使用最為廣泛的抗生素，目前其污染控制技術(shù)主要為堆肥，相應(yīng)的土霉素降解率僅為40％左右。因此，迫切需要找到一種堆肥強(qiáng)化手段以提高土霉素降解率。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種土霉素高效降解菌，其目的在于降解土霉素，由此解決普通不加菌堆肥法降解土霉素效率低下的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種能夠降解土霉素的蠟樣芽孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌0214 Bacillus cereus 0214，于2014年3月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2014061，保藏地中國武漢。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選土霉素高效降解菌的方法，包括以下步驟：

(1)單菌落培養(yǎng)：取受土霉素污染的豬糞制備成菌懸液，將菌懸液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)出細(xì)菌單菌落；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有400μg/ml至500μg/ml的放線菌酮；

(2)土霉素篩選：將步驟(1)中獲得的細(xì)菌單菌落，分別加入含土霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不斷提高基礎(chǔ)培養(yǎng)基中土霉素的濃度直至不低于200mg/L，保留能適應(yīng)所述土霉素濃度的細(xì)菌單菌落；

(3)土霉素降解菌篩選：將步驟(2)中獲得的細(xì)菌單菌落，分別加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，不斷提高土霉素濃度直至不低于200mg/L，分時(shí)段測定培養(yǎng)基內(nèi)土霉素含量和OD600，計(jì)算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的細(xì)菌；

所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基每升含：NaH₂PO₄0.05％～0.1％、K₂HPO₄0.05％～0.1％、(NH₄)₂SO₄0.1％～0.2％，pH值在7.0至7.4之間。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種蠟樣芽孢桿菌制劑，包括所述的蠟樣芽孢桿菌干粉和有機(jī)基質(zhì)，所述芽孢桿菌干粉和有機(jī)基質(zhì)質(zhì)量比例在1:4至1:5之間。

優(yōu)選地，所述蠟樣芽孢桿菌制劑，其特征在于，所述有機(jī)基質(zhì)為腐殖酸、玉米粉、淀粉、麩皮中的一種或多種；優(yōu)選腐殖酸。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述蠟樣芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

(a)將如權(quán)利要求1所述的蠟樣芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，接種量為2％-5％,直至形成芽孢不低于90％，獲得發(fā)酵液；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配置如下：大豆粉6～7％、玉米粉7～8％、麩皮1％～2％、腐殖酸0.5％～1％、NaH₂PO₄0.05％～0.1％、K₂HPO₄0.05％～0.1％和(NH₄)₂SO₄0.1％～0.2％，調(diào)pH值為7.0～7.4，高溫高壓滅菌15-30min。