[發明專利]一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌

有效

• 申請號: 201410246079.6
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN104004665A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 吳承禎;謝安強;徐彩瑤;洪偉;林勇明
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01N63/04;A01P21/00;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌。

背景技術

植物內生菌的研究始于19世紀末，Vogl從黑麥草Lolium?temulentum?L.種子中分離出第一株內生菌^[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。

前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌^[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為：固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌^[3-4]、具有抗病蟲害的生防菌^[5-7]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。

謝卿媚和黃建河（1985）^[8]對杉木內生菌根的形態特征及菌根真菌的鑒定，主要以杉根皮層組織與內生菌根真菌的共生結構作解剖學分析及以濕篩—傾析法從根際土中獲得的菌絲與厚垣孢子進行觀察。結果表明，根據杉木內生菌根的解剖學分析與根際土壤中厚垣孢子的形態結構特征，確定杉木內生菌根是屬于泡囊一叢枝型內生菌根（簡稱VA菌根）。進一步研究杉木內生菌根對杉木的生長發育及抗性方面的效應，充分合理的利用內生菌根制劑促進杉木生長的問題，具有重大的經濟價值。特別是在我國南方養分瘠薄的紅壤地區，研究內生菌根增強土壤中磷素的吸收，是當前南方紅壤地區杉木速生豐產中亟待解決的重要問題。綜上可知，關于杉木的內生真菌方面的研究僅從根部位進行鑒定研究，而對杉木葉部位和莖部位均未涉及內生真菌的研究。此外，有關內生真菌對杉木自身生長的影響研究還存在空白。

發明內容

本發明的目的在于提供一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌。

本發明提供的一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌，為絲葚霉（Papulospora?sp.）AJ14，已于2014年5月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC?No.?9187。

該菌的分離、純化包括：

A、材料：將采集得到不同年份的杉木根、莖段、葉分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4℃冰箱保存；

B、消毒：70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法^[9-11]；

C、接種部位的選擇：葉尖部、葉中部和葉基部3個處理；枝條：上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部：分為根尖和根基2個部分；

D?、接種：將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28℃恒溫培養箱內培養5—7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。

固體培養：使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨?5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值6.4±0.2，培養溫度為28℃，培養方式為平板培養，培養時間為48h；

E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的杉木內生真菌；

其無性孢子缺乏，菌絲淡色，產生小的細胞緊結成類菌核結構的球狀，黑色；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為絲葚霉屬（Papulospora?sp.）。

上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28℃，培養時間48～72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即為成品備用；液體培養基：為改良馬丁培養基,其中蛋白胨?5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌的應用方法，是應用該菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地澆根。