[發明專利]一種羅漢果SgCS基因的突變體及其用途

有效

• 申請號: 201410245775.5
• 申請日: 2014-06-04
• 公開（公告）號: CN104017798A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 馬小軍;趙歡;唐其
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/81;C12P33/00;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 郎堅;唐寧

技術領域

本發明涉及一種來源于羅漢果的SgCS基因的突變體及其在生產羅漢果甜苷V中的用途。?

背景技術

羅漢果(Siraitia?grosvenorii)中含有多種皂苷成分，目前已報道分離到了20多種羅漢果葫蘆烷型四環三萜型皂苷成分，其中羅漢果苷IV、苷V和賽門苷I是迄今為止報道的羅漢果甜苷中甜度最高的3種成分，分別為蔗糖甜度的392，425和563倍。在所有甜苷中，羅漢果苷V的含量最高，約占總皂苷含量的20％；同時作為主要的活性成分，羅漢果苷V具有鎮咳、祛痰，解痙活性，具有抗癌，抗炎，降血糖等作用，使之成為為數不多的從中藥中發掘出來的具有治療功能的新型甜味劑。羅漢果甜苷具有甜度高，熱量低，無毒，口感好，沒有甜菊苷的特殊苦味，2008年美國可口可樂公司新推出的飲料中添加了羅漢果苷V，2011年中國2家公司的羅漢果提取物也通過了通過美國FDA的GRAS認證，成功打入美國市場。但是由于市場上羅漢果苷提取物的價格居高不下，因此在食品、保健品、日用健康用品方面無法與蔗糖競爭。?

然而，羅漢果苷V的分布具有組織特異性，只存在成熟果實中，而且含量很低僅占果實干重的1％左右，占鮮果含量的3-4‰。常規雜交育種的手段來提高羅漢果苷V的含量難度大，周期長。首先，野生的羅漢果資源目前幾乎滅絕，而栽培品種單一化嚴重，遺傳背景狹窄(遺傳相似系數在0.9以上)；其次，異花授粉的羅漢果從遺傳角度來看是高度雜合的，近交后代性狀衰退明顯，培育純合型的品系難度極大；第三，羅漢果的品質屬于數量性狀，受微效的多基因控制，如果將多個親本上的優良性狀集中于某一個品種的培育周期過長；再者，作為雌雄異株的羅漢果，其實生苗的后代雌雄比例約為3:7，利用目前的手段無法在開花前判定其性別分化，每株植株在種植時占地面積約為4.5cm²，大量組合高品質形狀來篩選單株實生苗將極大浪費土地和資金；最后，采用多倍體育種的方法出現果實明顯變小的問題。近年來，提高羅漢果苷含量的研究成為熱門的研究方向。據統計，每提高1‰果實中羅漢果苷V含量可降低10％的提取成本。因此，我們認為從羅漢果苷V生物合成的相關酶入手，通過研究相關酶的基因功能，來調控解決羅漢果苷含量低的難題，將是一條更為直接、更加有效的新途徑。?

現有的報道一定程度預測了羅漢果甜苷生物合成途徑，首先經甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(MEP)兩條途徑形成異戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DAMPP之間可以相互轉化，MVA途徑發生在胞質中，MEP途徑發生在質體中。這是三萜皂苷生物合成共有的途徑，其中在MVA途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA?reductase,HMGR)催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成甲羥戊酸(mevalonate,MVA)，這一步反應是需要依賴于NADP的不可逆轉的過程，HMGR是該途徑中的關鍵限速酶，可以受洛伐他汀的專一性抑制。IPP和DMAPP能夠被牻牛兒基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)，IPP與GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸酯(FPP)，然后再經角鯊烯合酶(squalene?synthase,SQS)的催化形成角鯊烯(Squalene)，SQS是異戊二烯途徑中的限速酶,是一類與膜結合的蛋白，是具有兩種功能的酶，首先能夠催化2分子的法尼基焦磷酸(FPP)縮合生成前角鯊烯二磷酸(presqualene?diphosphate,PSPP)，接著在NADPH和Mg2+存在的情況下將PSPP轉化成角鯊烯，作為植物中甾醇和三萜化合物的第一個前體。SQS是三萜類物質生物合成途徑中的關鍵酶，其表達高低及活性強弱直接決定了下游產物的含量高低，目前已經在細菌、酵母、靈芝、動物、人類和植物中得到克隆分離。角鯊烯環氧化酶的繼續作用形成2,3-氧化角鯊烯，該物質是植物甾醇和三萜皂苷合成的共同前體物質，氧化角鯊烯的環化一步決定了下游的走?向，是植物甾醇還是三萜皂苷。在羅漢果中，葫蘆二烯醇合酶(cucurbitadienol?synthase，CS)和環阿喬醇合酶(cycloartenol?synthase，CAS)基因同屬于角鯊烯環化酶基因家族，其中CS能夠環化成葫蘆二烯醇，經過一系列的加羥基、加糖基反應生成羅漢果苷，是甜苷合成中的關鍵一步；而CAS能夠環化成環阿喬醇，在此基礎上經過基部修飾得到植物甾醇，CAS是植物甾醇及甾體類化合物合成的第一個關鍵酶。?