[發(fā)明專利]一種快速石蒜轉(zhuǎn)基因的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410244493.3
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN103993037A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江玉梅;汪仁;夏冰;徐晟;賀佳;李曉丹;彭峰
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種石蒜的轉(zhuǎn)基因方法，屬于植物改良和新品種開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

石蒜(Lycoris?radiata)是觀賞價值較高的一類草本花卉，具有花色鮮艷、花姿獨(dú)特及花后觀葉等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于園林地被綠化及鮮切花生產(chǎn)。而且石蒜所含的特有生物堿還具有重要的藥理價值。研究表明石蒜生物堿具有抗癌、消炎和膽堿酯酶抑制劑的作用，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療。但石蒜中重要生物堿的含量很低，不能滿足日益擴(kuò)大的需求，而且過度采集嚴(yán)重破壞石蒜野生資源。因此，提高石蒜植株中重要生物堿的含量是當(dāng)前石蒜開發(fā)利用迫切需要解決的問題。石蒜是我國石蒜屬植物中分布范圍最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的一個種，但是石蒜染色體核型為3倍體，不能通過常規(guī)的雜交手段來改良品質(zhì)；而且即使是可以種子繁殖的其他石蒜屬植物，從種子苗到開花至少需要3-4年，雜交育種周期很長。因此，石蒜轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的建立，不僅是石蒜改良的必由之路，而且對于其他石蒜屬植物的改良也具有高效優(yōu)勢，能夠大大縮短育種進(jìn)程。盡管石蒜組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)已經(jīng)成熟，愈傷組織誘導(dǎo)也有報道，但關(guān)于石蒜的轉(zhuǎn)基因方法尚未見報道，而且石蒜屬中也尚未有關(guān)于轉(zhuǎn)基因方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育轉(zhuǎn)基因石蒜的方法，為提高石蒜重要生物堿含量、改良石蒜觀賞品質(zhì)及相關(guān)依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支撐，同時對于石蒜屬其他植物轉(zhuǎn)基因方法的建立具有重要的借鑒意義。

本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可包括以下步驟：

A外植體處理：選取多年生石蒜的鱗莖洗凈，剝?nèi)ネ鈱喻[片，切除根部，切去鱗莖上半部分約1/2～2/3。將留有鱗莖盤的鱗莖均分為4～8塊，用0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min，流水沖洗30～60min后，再在超凈工作臺上用75％的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍后，用含1％的次氯酸鈉，無菌水沖洗4-5遍，最后用無菌濾紙吸干表面水分；

B愈傷組織誘導(dǎo)：將滅過菌的小塊鱗莖接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，配方如下：MS基本培養(yǎng)基中添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，濃度為0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和濃度為0.1～3.0mg/L激動素，在22-26℃、光照10-16小時/天的條件下進(jìn)行光照培養(yǎng)30～40天；

C農(nóng)桿菌侵染：石蒜與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基懸浮制成攜有目的基因的農(nóng)桿菌菌液浸泡石蒜愈傷組織20-60min進(jìn)行侵染，取出愈傷組織，接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上，再在22-26℃的條件下，進(jìn)行侵染2-4天；所述石蒜愈傷農(nóng)桿菌共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基上添加了濃度為0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，濃度為0.1～5.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，濃度為0.1～3.0mg/L激動素和濃度為180-220μM的乙酰丁香酮，質(zhì)量百分比濃度為0.8-1.2％的葡萄糖，濃度為0.08-0.12g/L的干酪素水解物；

D恢復(fù)培養(yǎng)：將農(nóng)桿菌侵染后的石蒜愈傷組織置于不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上，再在22-26℃、光照10-16小時/天的條件下恢復(fù)培養(yǎng)6-14天；所述不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基上添加濃度為0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，濃度為0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，濃度為0.1～3.0mg/L激動素和對農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素；

E抗性篩選：將恢復(fù)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)接至特定抗性的培養(yǎng)基上，在22-26℃、光照10-16小時/天的條件下培養(yǎng)10-20天，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選；所述特定抗性培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基上添加濃度為0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，濃度為0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，濃度為0.1～3.0mg/L激動素和所轉(zhuǎn)載體攜有的抗性如卡那抗性；

F轉(zhuǎn)基因組織GUS染色鑒定：將抗性篩選后的愈傷組織和未轉(zhuǎn)基因的對照愈傷組織，通過X-Gluc染色后，顯微鏡觀察；

G轉(zhuǎn)基因石蒜愈傷組織的再生：一次抗性篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)接至叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上，在22-26℃、光照10-16小時/天的條件下培養(yǎng)30-40天，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)與篩選；將獲得叢生芽轉(zhuǎn)接于生根篩選培養(yǎng)基上，在22-26℃、光照10-16小時/天的條件下培養(yǎng)20-30天，進(jìn)行生根誘導(dǎo)與篩選；所述叢生芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基上添加濃度為0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，濃度為0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和所轉(zhuǎn)載體攜有的抗性；所述生根誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基上添加濃度為0.1～5.0mg/L的萘乙酸和所轉(zhuǎn)載體攜有的抗性；