[發(fā)明專利]表達PTA基因的重組腺病毒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410243351.5
• 申請日: 2014-05-31
• 公開（公告）號: CN104031940A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 徐濤;高永;周偉
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N7/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發(fā)明屬生物醫(yī)學領域，特別涉及含表達三葉半夏凝集素(Pinellia?Ternate?Agglutinin,PTA)基因重組腺病毒表達載體pAd/CMV/V5-DEST-PTA、重組腺病毒及其PTA活性的測定。

背景技術

三葉半夏凝集素(Pinellia?ternata?agglutinin，PTA)是一種從三葉半夏中分離出來具有凝血活性的三葉半夏蛋白，具有與甘露糖及其聚合物專一結合的性質，研究發(fā)現三葉半夏凝集素能和生長旺盛的肝癌細胞結合并使其凝集，對人類及動物反轉錄病毒(包括HIV)具有抑制作用，并在生殖和避孕方面也起到一定的作用等，成為近年來研究的熱點。

基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因，通過一定方式導入人體細胞，以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病的目的。基因治療為惡性腫瘤、心血管疾病、遺傳病和艾滋病等嚴重威脅人類健康的疾病提供了治療的可能。基因治療中常用的載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體主要包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等。腺病毒載體由于其具有宿主細胞廣泛、可感染靜止及分裂期細胞、繁殖滴度高、性質穩(wěn)定包裝容量大及不整合等優(yōu)點，而被廣泛應用的在基因治療中，尤其是用于體內基因治療研究。由于腺病毒載體在哺乳動物及其多種細胞上進行基因轉移和蛋白質表達的高效性，使其在基因治療的研究中受到人們的青睞，成為當今使用最多的病毒載體之一。

從上世紀九十年代以來，報道的1000多種基因治療的臨床方案中，約26％是用腺病毒作為基因治療的載體。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種構建含三葉半夏凝集素基因重組腺病毒表達載體，并提供一種表達PTA的重組腺病毒，該重組腺病毒可用于體內基因治療方面的研究，為因氧化應激所引發(fā)的各種惡性腫瘤、心血管疾病、各種免疫缺陷性等疾病的基因治療提供了的一種新穎的技術。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種含表達三葉半夏凝集素(Pinellia?Ternate?Agglutinin,PTA)基因重組腺病毒表達載體：將PTA基因依次插入pcDNA3.1+、入門載體pENTR1A，再利用體外重組技術體外重組pENTR1A-PTA和腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST，得到含PTA基因的重組腺病毒表達載體。

作為本發(fā)明的含表達三葉半夏凝集素(Pinellia?Ternate?Agglutinin,PTA)基因重組腺病毒表達載體的改進：所述含PTA基因的重組腺病毒表達載體是利用通路克隆系統，使PTA基因先插入入門載體pENTR1A中，利用入門載體和腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST的同源序列，使其體外重組，得到pAd/CMV/V5-DEST-PTA重組腺病毒表達載體。

作為本發(fā)明的含表達三葉半夏凝集素(Pinellia?Ternate?Agglutinin,PTA)基因重組腺病毒表達載體的進一步改進：

所述pAd/CMV/V5-DEST-PTA是E1、E3區(qū)缺失的復制缺陷5型腺病毒表達載體。

備注說明：pAd/CMV/V5-DEST是E1、E3區(qū)缺失的復制缺陷5型腺病毒表達載體，可市購獲得；pAd/CMV/V5-DEST-PTA同是E1、E3區(qū)缺失的復制缺陷5型腺病毒表達載體，是本發(fā)明經過加入PTA基因獲得的重構新型病毒。

本發(fā)明還同時提供了一種含PTA基因重組腺病毒：該病毒是通過如上所述的含PTA基因重組腺病毒表達載體轉染人胚腎293A細胞得到。

作為本發(fā)明的含PTA基因重組腺病毒的改進：所述表達含PTA基因重組腺病毒是通過脂質體介導法轉染人胚腎293A細胞得到。

作為本發(fā)明的含PTA基因重組腺病毒的進一步改進：所述人胚腎293A細胞提供反式補償，使得缺失E1元件的病毒可以在該細胞中復制和擴增。

作為本發(fā)明的含PTA基因重組腺病毒的進一步改進：所述含PTA基因重組腺病毒中所含的PTA的含量是通過免疫印跡法進行測定的。