[發明專利]檢測酸性橙的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410240858.5
• 申請日: 2014-06-03
• 公開（公告）號: CN105301244B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 萬宇平;羅曉琴;何方洋;馮靜;楊秀賢;吳鵬;劉春雪;張芝
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測酸性橙的酶聯免疫試劑盒，其特別適于腌鹵肉、豆瓣醬和辣醬中酸性橙含量的檢測。

背景技術

酸性橙(Acid orange)，又名金橙Ⅱ、橙黃Ⅱ、二號橙、桔黃橙、酸性金黃或酸性艷橙，俗名為“金黃粉”，化學名稱為2-萘酚偶氮對苯磺酸鈉。酸性橙是一種化工染料，主要用于皮革、蠶絲和羊毛等紡織物染色，該染料中有大量的化學助劑，如果長時間在那種環境下，有可能對將來的生育造成影響，比如不孕或者畸形兒，對自身健康也可能有影響，為中等毒性致癌化合物，被禁止作為食品添加劑使用。但由于其具有色澤鮮艷、著色穩定、價格低廉等特點，一些不法商販為牟取暴利，將其作為食用色素用于食品、藥材的生產和加工。在我國市售和出口的蜜餞、辣椒面、豆制品、紅瓜子和鹵制品等農產品中均檢出過含有酸性橙等非食用色素，嚴重危害了消費者的健康。因此，建立一套快速、有效地檢測食品中添加的非食用色素酸性橙的方法具有重要意義。

目前文獻報道有關酸性橙的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、反向高效液相色譜法(Re-HPLC)、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)、超高效液相色譜法(UPLC)、薄層色譜掃描法、熒光光譜檢測法等。在這些方法中，薄層色譜掃描法靈敏度不高，不適合作痕量酸性橙分析；熒光光譜檢測法剛開始用于酸性橙的檢測，應用較少。UPLC法檢測速度最快，但設備要求也最高；HPLC以及HPLC-MS法是應用最廣泛的方法，準確、穩定、可靠，也是目前測定酸性橙的標準方法，但儀器設備價格昂貴，且樣品前處理繁瑣、耗時，需要大型儀器設備和專業的技術人員，難于實現現場操作，不宜推廣應用。而基于抗原抗體特異性反應的酶聯免疫吸附法(ELISA)具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣本的篩選檢測等優點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國食品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作，極具發展潛力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于酸性橙檢測的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣本篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、酸性橙單克隆抗體、酶標記物、酸性橙標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為酸性橙偶聯抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。

所述酸性橙偶聯抗原是由酸性橙半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述酸性橙半抗原是由酸性橙Ⅱ與對氨基苯甲酸反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述酸性橙單克隆抗體是以酸性橙偶聯抗原作為免疫原制備獲得。

所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。

所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括酸性橙標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述酸性橙標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為質量體積百分比。

所述復溶液優選為pH值為7.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。

其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為質量體積百分比。