[發明專利]一種改造的家蠶桿狀病毒載體及利用其提高NS1表達量的方法

無效

• 申請號: 201410240766.7
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104017826A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 李國輝;李芒芒;唐琦;胡朝陽;姚勤;周倩;陳克平
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程技術，公開了一種新穎的家蠶桿狀病毒表達載體的構建流程及其在蛋白表達中的應用。?

背景技術

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(BEVS)通過制備攜帶有外源基因的重組桿狀病毒，感染昆蟲或昆蟲細胞進行外源蛋白的表達，表達產物具有正確的空間折疊和糖基化等修飾，其生物活性接近其對應的天然產物。在BEVS中，常用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)或者家蠶核型多角體病毒(BmNPV)用作重組病毒構建的載體，而在表達外源蛋白時，我們傾向選擇家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，這與我國的家蠶資源豐富及大規模養殖密切相關(Maeda?et?al.,Nature,1985,315:592–594)，容易獲得大量的目標蛋白。家蠶桿狀病毒具有容納外源大片段DNA或同時表達多個外源基因的能力；另外，家蠶桿狀病毒不感染人、畜等脊椎動物，表達外源蛋白所需時間周期也遠短于動物或植物系統，可通過昆蟲或細胞培養對外源蛋白進行大規模生產，這些特性使BEVS成為目前最有效、應用最廣泛的一種真核表達系統(Kato?et?al.,Appl?Microbiol?Biotechnol,2010,85:459-470)。?

家蠶是我國一種具有重要經濟價值的昆蟲，主要以桑葉為食，只需要簡單的設備就可對家蠶進行大規模飼養，其生產的蠶絲是我國農業經濟的重要組成部分，在改善民生和可持續發展中起著重要作用；同時，由于家蠶飼養成本低廉，在家蠶體內表達外源蛋白，所需時間較短，容易對靶蛋白進行大規模生產，是一種非常優良的生物反應器，也是實現基因工程產業化的理想載體；2009年已完成對家蠶全基因組序列的測定和分析(Xia?et?al.,Science,2009,326:433–436)，遺傳背景清楚，有利于我們對家蠶進行遺傳改造，培育出更適合外源蛋白表達的家蠶新品種。另外，Luckow等(Luckow?et?al.,J?Virol,1993,67:4566-4579；Possee?et?al.,Biotechnol?Bioeng,2008,101:1115–1122)建立了一種高效、快速的用來構建重組病毒的篩選體系，剔除了多輪空斑篩選的繁瑣程序，提高重組病毒的陽性得率，由此，極大地簡化了家蠶重組桿狀病毒的構建、分離、鑒定以及定量，家蠶桿狀病毒表達系統的應用由此得到了推廣。自1985年利用該系統首次成功表達人干擾素-α(IFN-α)(Maeda?et?al.,Nature,1985,315:592–594)以來，截止到目前為止，已通過BEVS在家蠶體內成功地表達了乙型肝炎表面抗原、人酸性/堿性成細胞生長因子、熒光素酶以及纖維素酶等上千種具有重要功能的重組蛋白(Lihoradova?et?al.,Mol?Biol,2004,38:603–607；Wu?et?al.,Protein?Expr?Purif,2001,21:192-200；Palhan?et?al.,Biotechniques,1995,19:97–104；Lee?et?al.,Biotechnol?Lett,2006,28:645–650)，現?已廣泛應用于重組蛋白藥物的研發、疫苗生產以及重組病毒殺蟲劑等系列研究領域中，在生產實踐中具有廣闊的應用空間和發展前景。?

盡管BEVS系統有諸多優勢以及技術上的不斷改進，但在實踐中還是面臨著一些挑戰，比如在培養的昆蟲細胞中表達外源蛋白，其生產成本較為昂貴(Tiwari?et?al.,Mol?Biotechnol,2010,46:80–89)；在家蠶等昆蟲體內表達外源蛋白，其成本雖然較低，但又增加了從昆蟲體內分離及靶蛋白純化的難度；BEVS系統中缺乏有效的熒光信號，難以對轉染的細胞中是否產生感染性的重組病毒粒子進行快速判定，影響外源蛋白表達的進程；另外，與原核表達系統相比，BEVS表達的外源蛋白，其產量相對較低，尤其是感染后的細胞最終會裂解，致使靶蛋白的表達水平及其修飾還未達到最佳狀態(Ikonomou?et?al.,Appl?Microbiol?Biotechnol,2003,62:1–20)，而通過ie1早期啟動子替代多角體晚期啟動子可以連續表達靶源蛋白，使其糖基化修飾得到高效加工，但降低了靶蛋白的表達量(Jarvis?et?al.,Biotechnology,1990,8:950–955)，這些不足之處在一定程度上都限制了BEVS系統的使用。因此，為優化家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，有必要對家蠶桿狀病毒穿梭載體上的一些序列進行改造，簡化重組病毒粒子鑒定的方法，縮短外源蛋白表達所需時間，提高BEVS中外源蛋白的表達產量及其穩定性。?