[發明專利]一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白的方法

在審

• 申請號: 201410239002.6
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN103966253A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 肖衛華;鐘永軍;鄔婧;方芳;馬佳佳;苗玉輝
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K19/00;C12R1/84
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及用畢赤酵母生產重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，高效表達rhIL33-Fc的畢赤酵母工程菌及所表達的重組蛋白。

背景技術

白細胞介素-33(IL-33)是IL-1家族的成員，它與IL-1β和IL-18類似，在機體的免疫反應中發揮著重要的作用。IL-33是一個30kDa的蛋白，進化上比較保守，人源的序列與小鼠來源的序列有54％的同源性。正常的IL-33主要表達于內皮細胞和表皮細胞內，它的釋放經常伴隨著機體的損傷或細胞的壞死，因而它也被認為是一種警示蛋白(Alarmin)。IL-33通過與細胞表面的受體ST2結合而招募MyD88，IRAK1/4和TRAF6，進而導致NF-κB的激活和Th-2促炎癥因子的釋放，如IL-4，IL-5和IL-13等因子。釋放到血液中的IL-33有利于促進機體防御寄生蟲，細菌感染和病毒感染，甚至它還被認為具有保護心肌的功能。

本發明前，市場上出售的重組人白細胞介素-33(rhIL-33)主要是用大腸桿菌表達和制備的。眾所周知，在大腸桿菌中重組表達的蛋白容易形成包涵體，進而涉及復雜的變復性過程，且整個系統會產生大量的內毒素等諸多不利因素。因而，用傳統的方法來制備白細胞介素-33(rhIL-33)大大增加了生產成本，且生產技術復雜，生產工藝不穩定。同時，當前用大腸桿菌制備的重組人白細胞介素-33(rhIL-33)的分子量約為18kDa，當其被用于動物體內或人體內時極易被腎小球過濾除去，嚴重影響了其潛在的生理功能和作為一個候選藥物的應用前景。特別的，目前還沒有成功地表達制備重組人白細胞介素-33(rhIL-33)與Fc的融合蛋白(rhIL33-Fc)的報道，也為沒有成功地運用畢赤酵母來表達制備重組人白細胞介素-33(rhIL-33)的報道。

綜上，當前急需要一種簡便，活性高，產量高和有產業化應用前景的重組人白細胞介素-33蛋白的制備方法。

發明內容

本發明提供了一種利用畢赤酵母表達和制備重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，其包括了重組表達質粒的構建、高效表達菌株的篩選、工程菌株發酵條件的優化和重組人白細胞介素-33蛋白的分離純化。通過以下步驟實現本發明：(1)構建表達載體，其包含啟動子、終止子、抗生素抗性基因、分泌信號肽和重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)的編碼序列；(2)電轉畢赤酵母，利用抗生素濃度梯度來篩選高效表達克隆；(3)優化工程菌株的發酵條件；(4)分離純化重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)蛋白。

具體的，本發明涉及以下各項：

1.一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次包括以下元件：

(1)畢赤酵母啟動子；

(2)信號肽序列；

(3)重組人白細胞介素-33與IgG1-Fc融合蛋白(rhIL33-Fc)的序列；

(4)轉錄終止子。

2.根據1所述的表達盒，其中所述畢赤酵母啟動子為pGAPZα-A質粒的GAP啟動子或pPIC9K質粒的AOX1啟動子；所述的信號肽為α-factor序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述rhIL33-Fc的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述的轉錄終止子為pPIC9K質粒的AOX1轉錄終止子元件。

3.一種表達載體，其包含1-2任一項所述的表達盒。

4.一種畢赤酵母工程菌，其包含3所述的表達載體。

5.一種重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)，其氨基酸序列如SEQID No:3所示。

6.一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，其包括表達4所述的畢赤酵母工程菌的步驟。

7.一種提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法，其特征在于以山梨醇和其它碳源的混合碳源作為碳源。

8.根據7所述的方法，其中所述其它碳源優選葡萄糖和/或甘油。

9.根據6所述的方法，其包含7或8所述的提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法步驟，其中山梨醇和其它碳源的混合比例可以適當調節，優選1：1，1：2或1；3。

10.6或9所述的方法表達的rhIL33-Fc。