[發明專利]間質干細胞體內突變腫瘤細胞株K3及其應用

在審

• 申請號: 201410236304.8
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104232583A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 錢暉;許文榮;張斌;毛飛;朱偉;丁小青;王興忠;謝穎;葉惠慧
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/095;C12R1/91
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于細胞的體外培養領域，更具體的，本發明涉及一種大鼠骨髓來源的間質干細胞體內突變腫瘤細胞株及其應用。?

背景技術

間質干細胞(mesenchymal?stem?cells,MSCs)是一類具有自我更新(self-renewal)和多向分化(multiple?differentiation)潛能的細胞群體。MSCs存在于骨髓、脂肪組織、臍帶及外周血等多種組織器官，在體外可以誘導成各種組織細胞，如成骨細胞、脂肪細胞、橫紋肌及平滑肌細胞以及神經膠質細胞等。MSCs存在范圍廣，易于獲得，增殖能力強，便于體外分離培養，研究報道MSCs可誘導分化為心肌細胞、神經細胞、成骨細胞并能夠下調免疫應答。目前，MSCs成為細胞工程和基因治療中理想的工具。?

許多研究提示應用MSCs進行細胞治療時應采用第4代以前的MSCs，以避免其發生突變致瘤，但也有少數研究者在MSCs應用的安全性方面提出質疑。我們實驗室于2004年首次建立了人胚胎骨髓MSCs體外突變細胞株F6，此突變是在MSCs定向誘導分化過程中發生的，突變后的MSCs形態變圓，核型異常，對免疫缺陷裸鼠有較強的致瘤能力，瘤組織病理類型為纖維肉瘤。另外也有學者發現，MSCs分離后在用含10％胎牛血清DMEM培養時也會發生突變，突變的細胞增殖速度變快，接觸抑制現象消失，靜脈注射入裸鼠體內可在肺部形成纖維肉瘤。?

除了體外培養及誘導分化過程中發現MSCs突變致瘤外，MSCs用于在體內研究時也出現了致瘤現象。將熒光素酶基因標記的MSCs用于體內活體成像觀察時發現一些高表達熒光蟲素酶的小鼠死亡，而存活的小鼠肺中都出現纖維肉瘤，并且有兩只小鼠還出現了骨肉瘤，同時MSCs突變的肉瘤細胞可以二次致瘤。多個研究提示MSCs突變可以在裸鼠體內形成肉瘤，甚至有學者提出尤文氏等骨肉瘤是來源于MSCs體內突變產生的。本實驗室為深入探討骨髓MSC體內致瘤的可能性，利用大鼠骨髓MSC反復尾靜脈注射后，20個月后在原位注射點形成了自發突變的腫瘤，隨后克隆培養了大鼠骨髓MSC體內突變的腫瘤細胞株，并將其命名為K3細胞株，進一步證明了K3細胞具有腫瘤細胞的多種生物學特性，為研究MSC突變的腫瘤細胞的生物學特性及MSC安全應用提供理論基礎。?

因為目前對MSCs的致瘤性觀察時間多以月計算，缺乏長期的實驗室監測，對突變的MSC研究也不夠深入。因此間質干細胞體內突變腫瘤細胞株的建立為研究間質干細胞體內瘤化的機制及腫瘤干細胞的生物學研究具有重要作用，為盡量減少間質干細胞在體內瘤化，提高其應用的安全性具有重要科研價值。?

發明內容

基于此本專利提供了一種新的間質干細胞體內突變腫瘤細胞株及其應用。?

本發明所述的間質干細胞體內突變腫瘤細胞株，命名為K3，保藏編號CGMCC?NO.9158。?

本發明間質干細胞體內突變腫瘤細胞株構建方法，包括以下步驟：?

(1)雄性大鼠骨髓MSC的分離培養；?

(2)SD大鼠致瘤試驗：得到的雄性大鼠MSC制備成單細胞懸液，調整細胞濃度為2×10⁶，取10只雌性SD大鼠，每只在0d，3d，7d，14d，21d分別尾靜脈注射大鼠MSC。長期觀察注射部位是否成瘤，20個月后自發突變成瘤；?

(3)突變腫瘤細胞培養：在無菌條件下取尾部腫瘤組織，200目鋼網過濾掉大的團塊后收集沖洗液，用密度為1.077g/mL的Ficoll液分離，1000rpm離心5min。取單個核細胞，PBS洗滌3次后棄上清，DMEM培養基重懸細胞，置5％CO2、飽和濕度、37℃二氧化碳培養箱培養；?

(4)有限稀釋克隆法獲得單克隆的間質干細胞源腫瘤細胞株：培養的致瘤大鼠的瘤細胞有限稀釋至1個細胞/200μL，接種于96孔培養板，顯微鏡觀察，標記上有單個細胞的每孔，置5％CO2、飽和濕度、37℃二氧化碳培養箱培養，每天持續觀察，篩選出單個貼壁瘤細胞孔后繼續培養，獲取有增殖能力的一株?單細胞克隆(命名為K3)；?

(5)雄性的性別決定(SRY)基因擴增鑒定K3細胞的來源：提取雄性大鼠MSC、K3細胞和致瘤鼠骨髓MSC的基因組DNA，PCR擴增SRY基因；?