[發明專利]來自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其調節畜禽免疫應答的用途

在審

• 申請號: 201410235117.8
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104161776A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 王進波;齊莉莉;費明明;梅樂和
• 申請（專利權）人: 浙江大學寧波理工學院
• 主分類號: A61K35/74
• 分類號: A61K35/74;A61P37/02;A61P31/04
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術領域：

本發明涉及調節畜禽免疫應答的丁酸梭菌細胞壁脂磷壁酸，所述免疫應答是由致病菌或其菌體成分誘導。?

背景技術：

腸道傳染病是集約化畜禽養殖中最常見的傳染病之一，主要由致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌等病原引起。這類疾病的傳染性強，死亡率高，對畜禽養殖業的危害十分嚴重。這些腸道傳染病病原還可能從動物傳播到人，引發人體腸道疾病，對消費者的身體健康造成潛在威脅。目前，飼料中添加抗菌藥物仍是防治畜禽腸道傳染病的主要手段。但這一防治手段帶來的系列問題已成為社會關注的焦點：(1)長期使用抗菌藥物導致病原菌產生耐藥性，這給動物甚至人類傳染性疾病防控帶來了更大的困難；(2)會在畜禽肉蛋奶類產品產生抗菌藥物殘留，危害消費者的健康；(3)未被畜禽消化、吸收和降解的抗生素隨動物糞便排出體外，對土壤、水體造成污染，間接危害消費者的健康。在傳統的畜禽養殖過程中，畜禽腸道傳染病的發生率則很低。這是因為正常動物腸道中生存者大量共生菌，這些共生菌能夠通過群體效應，抑制病原菌在腸道中的粘附、定植與侵染，調控動物腸道免疫應答反應，防止腸道傳染病的發生。基于這一背景，人們開發了多種微生態制劑，通過調節動物腸道菌群結構來防治動物腸道傳染病。微生態制劑具有不導致細菌產生耐藥性、無殘留、環境友好等優點，但微生態制劑的作用效果受動物種類、年齡、養殖環境、飼料加工方式和投喂方式等多種因素影響，不易于實施。?

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種能夠改善畜禽的腸道免疫功能，抑制病原菌在腸粘膜細胞表面的粘附定植，降低腸道傳染病發病率，提高畜禽養殖業經濟效益的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸。?

本發明運用TritonX-114破碎丁酸梭菌細胞，再用離子交換樹脂分離純化脂磷壁酸，進而利用截留分子量為3500的半透膜進行透析，除去其中的雜質，獲得純的脂磷壁酸；具體制備步驟包括：?

(1)向40-60mmol/L、pH6-7的Tris-HCl緩沖液中加TritonX-114(TRITONX-114CAS:9036-19-5)，配制成質量百分比為1.5-2.5％的TX-114溶液(即TRITONX-114質量百分比為1.5-2.5％的TRITONX-114溶液)，置于4℃冰箱保存，備用；?

(2)取8-16mL經45-50h培養的丁酸梭菌液于若干支質量已知的塑料離心管中，常溫、4500-5000rpm離心25-40min，除去上層培養液后再稱各管質量，計算得到菌體濕重；?

(3)按照每1g濕菌(步驟2的菌體)添加8-12mL步驟(1)的1.5-2.5％％TX-114溶液的比例混合，磁力攪拌器攪拌裂解菌體25-40min，4℃靜置過夜；然后4℃、4500-5000rpm離心25-40min，去除細菌碎片，收集上層提取物；提取物置于45-50℃水浴中25-30min，然后常溫4500-5000rpm離心25-40min，收集上層水相，即為脂磷壁酸的粗提取物；?

(4)先用0.1M(mol/L)pH4.7的醋酸銨緩沖液預平衡DEAE-纖維素層析柱(2×20cm即直徑×長度)，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其體積的0.1MpH4.7的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱；用同一緩沖液(0.1MpH4.7的醋酸銨緩沖液)洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸銨緩沖液洗脫結合于柱上的脂磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A₂₇₅監測脂磷壁酸洗脫峰；得到脂磷壁酸。?

作為優選，本發明步驟(1)的Tris-HCl緩沖液為50mmol/L、pH6.5，TX-114溶液質量百分比濃度為2％。?

作為優選，步驟(3)每1g濕菌添加10mL的2％TX-114溶液。?

本發明步驟(2)的丁酸梭菌液培養條件為：37℃厭氧培養，其培養基為MRS培養基，MRS培養基配方：酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、吐溫-801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸錳0.2g、七水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、蒸餾水1000mL，pH7.0。?