[發明專利]一種中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和應用

有效

• 申請號: 201410234434.8
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104004734A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 姚斌;羅會穎;王彩虹;黃火清;柏映國;石鵬君;王亞茹;楊培龍;孟昆;師霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，一種中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和應用。

背景技術

甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷鍵連接而成的線性多糖。β-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan?mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一種能降解甘露聚糖主鏈的水解酶，屬于半纖維素酶類。β-甘露聚糖酶已被廣泛應用于食品、飼料、醫藥、造紙、紡織印染、石油開采、精細化工及生物技術等諸多領域，是一種新型的工業酶，具有很大的潛在應用價值。

許多微生物，植物和一些低等動物中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler,et?al?FEMS?Microbiol.Lett.1996.141:183–188)。微生物是β-甘露聚糖酶的重要來源，具有活力高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點。但天然菌株所產的甘露聚糖酶產量低，不能滿足工業化生產的需要。隨著分子生物學的發展，部分甘露聚糖酶的編碼基因已被克隆并進行了異源表達(Dhawan?and?Kaur,Crit.Rev.Biotechnol.2007.27:197–216；Moreira?and?Filho,Appl.Microbiol.Biotechnol.2008.79:165–178.)根據催化域氨基酸序列及結構的相似性，β-甘露聚糖酶多被劃分為糖苷水解酶家族5,11或113(Henrissat?and?Bairoch,Biochem.J.1993.293:781-788)。

不同來源的甘露聚糖酶因性質上的差別,其應用范圍和價值也不盡相同。國內外研究和報道較多的細菌產甘露聚糖酶多為中性或堿性酶，包括芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌、放線菌等。而真菌來源的β-甘露聚糖酶多為酸性，它們作用的最適pH值在2.4～5.0。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大約在45kDa～55kDa，最適作用pH為4.0～6.0，最適作用溫度為55℃～75℃。相對細菌而言，真菌來源的β-甘露聚糖酶最適反應pH值、pH穩定性都偏低，耐熱性比細菌差。

本發明得到了一個新的甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶在酸性和中性條件下有高的酶活性，較好的耐熱性和極好的抗蛋白酶能力，可應用于動物及魚類的飼料，應用于食品、醫藥等工業，同時還可以應用于造紙及紡織印染行業。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產中性β-甘露聚糖酶。

本發明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

本發明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重組載體。

本發明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重組菌株。

本發明的再一目的是提供一種制備中性β-甘露聚糖酶的方法。

本發明的再一目的是提供上述中性β-甘露聚糖酶的應用。

本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、適合于在飼料、食品、釀酒、造紙以及能源工業中應用新的β-甘露聚糖酶。本發明人篩選到一種天然菌株，它所產生的β-甘露聚糖酶適合于在飼料、食品、釀酒、造紙以及能源工業中使用。

從上述真菌中獲得了一種中性β-甘露聚糖酶Man26DW1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1

其中，該酶全長468個氨基酸，N端18個氨基酸為信號肽序列“MVFTSTYALAALFTFTAA”。

因此，成熟的中性β-甘露聚糖酶Man26DW1的理論分子量為49kDa，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2

本發明還提供了編碼上述中性β-甘露聚糖酶的基因。

該酶的全基因序列如SEQ?ID?NO.3所示：

本發明通過PCR的方法分離克隆了這一β-甘露聚糖酶基因man26DW1,DNA全序列分析結果表明，β-甘露聚糖酶Man26DW1結構基因man26DW1全長1461bp，含有1個內含子，+131～+187bp為其內含子序列，cDNA長1404bp，其cDNA序列如SEQ?ID?NO.4所示。

其中，信號肽的堿基序列為：ATGGTGTTCA?CTTCAACATA?TGCCCTGGCG?GCACTCTTTACTTTCACCGC?AGCT。

成熟基因的編碼序列如SEQ?ID?NO.5所示：