[發(fā)明專利]維甲酸誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410233756.0
• 申請(qǐng)日: 2014-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN105132362A
• 公開（公告）日: 2015-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸華;萬謙;劉志斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;杜朗宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及維甲酸的新用途，具體涉及維甲酸作為干細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑中的用途。

背景技術(shù)

胚胎干細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為多種不同種類的細(xì)胞，比如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等^[1]。目前，干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)系統(tǒng)被廣泛研究，多種誘導(dǎo)物被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)行體外分化，包括PDGF、BMP2、BMP4、ActivinA、bFGF、Wnt3a、RA、FGF、DMSO和TGF-b1等^[2–6].

維甲酸(RA)是維生素A的衍生物，其已被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化^[7]。特別之處在于，RA能顯著刺激Stra8的表達(dá)，這是RA干預(yù)干細(xì)胞后的標(biāo)志事件^[8]。

前期研究中發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸(OA)和維甲酸(RA)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞1B10(MESC-1B10)具有相似的作用：能誘導(dǎo)MESC-1B10向雌性和雄性生殖細(xì)胞分化，但是同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞D3(MESC-D3)的影響不同：OA能誘導(dǎo)MESC-D3向雌性和雄性生殖細(xì)胞分化，而RA不能誘導(dǎo)MESC-D3向生殖細(xì)胞分化^[11]。根據(jù)前期的試驗(yàn)可以看出，不同的小鼠胚胎干細(xì)胞對(duì)于RA具有不同反應(yīng)。

小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E(MESC-R1/E)細(xì)胞株于1991年八月被建立，來源于小鼠129X1品系與129S1品系交配后形成的3.5天齡的囊胚，它的性別為雄性，同時(shí)這株細(xì)胞被表明能形成生殖細(xì)胞^[21]。它與MESC-1B10、MESC-D3屬于小鼠干細(xì)胞的不同細(xì)胞株，它們之間具有不同的遺傳背景。

目前還未見維甲酸對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E誘導(dǎo)分化的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供維甲酸作為誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E干細(xì)胞分化劑中的用途。

本發(fā)明提供了維甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物在制備將小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E定向分化為雌性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化劑中的用途。

誘導(dǎo)分化劑，即誘導(dǎo)細(xì)胞分化的物質(zhì)，這種物質(zhì)可以是單一化合物，也可以是多種成分的組合，其存在或使用的形式可以是固體、半固體，也可以是液體。

進(jìn)一步地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為維甲酸與金屬離子或酸形成的鹽。

其中，金屬離子成鹽形式多采用維甲酸與金屬離子形成的鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽等，常用的成鹽手段是將維甲酸與相應(yīng)堿反應(yīng)制備而成；除與金屬離子成鹽外，維甲酸還可以與酸成鹽，包括藥學(xué)上常見的有機(jī)酸或無機(jī)酸，如鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽等。

進(jìn)一步地，所述藥學(xué)上可接受的酯為維甲酸與C1-C4醇形成的酯。

其中，所述C1-C4醇為甲醇或乙醇。

進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化劑是上調(diào)GDF-9、Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3基因表達(dá)、下調(diào)Itag6、Itgb1基因表達(dá)的誘導(dǎo)分化劑。

其中，將小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E定向分化為雌性生殖細(xì)胞的具體操作步驟為：

a、取小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E；

b、置于含有的維甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不低于72小時(shí)，即得雌性生殖細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟b所述培養(yǎng)液中維甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物的含量以維甲酸計(jì)為3μg/ml。

“含量以維甲酸計(jì)”，表明維甲酸藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物在培養(yǎng)液中的含量也通過維甲酸進(jìn)行換算。

進(jìn)一步地，步驟b中，所述培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。

本發(fā)明還提供了一種將小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E定向分化為雌性生殖細(xì)胞的方法，它包括如下操作步驟：

a、取小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E；

b、置于含有的維甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不低于72小時(shí)，即得雌性生殖細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟b所述培養(yǎng)液中維甲酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物的含量以維甲酸計(jì)為3μg/ml。

進(jìn)一步地，步驟b中，所述培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。

本發(fā)明研究表明，RA能誘導(dǎo)MESC-R1/E向雌性生殖細(xì)胞分化，但不能向雄性生殖細(xì)胞分化，可以將RA或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物作為將小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E定向分化為雌性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化劑使用。