[發(fā)明專利]一種抗前列腺癌貽貝糖蛋白及其制備和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410233476.X
• 申請(qǐng)日: 2014-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN104177484A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 遲長(zhǎng)鳳;王斌;陳蔭;李濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種貽貝糖蛋白其特征在于該貽貝糖蛋白的分子量約為16.9?kDa；所述的貽貝糖蛋白含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵；所述的貽貝糖蛋白組分在280?nm?處有蛋白質(zhì)特征吸收值，用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490?nm?又有多糖特征吸光值。

2.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于所述的貽貝糖蛋白中糖和蛋白含量分別為23.54%?和76.46%。

3.如權(quán)利要求1?所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分的半數(shù)降解溫度為63.5?°C。

4.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分經(jīng)GC/MS測(cè)定，糖蛋白中單糖的組成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.00：2.01：6.93：7.27：4.05。

5.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分經(jīng)氨基酸分析儀分析，糖蛋白中的蛋白由15中氨基酸組成，其中每1000個(gè)氨基酸殘基中，丙氨酸113殘基/1000殘基、精氨酸65殘基/1000殘基、天冬氨酸87殘基/1000殘基、谷氨酸91殘基/1000殘基、甘氨酸165殘基/1000殘基、組氨酸4殘基/1000殘基、異亮氨酸??11殘基/1000殘基、亮氨酸31殘基/1000殘基、賴氨酸20殘基/1000殘基、蛋氨酸11殘基/1000殘基、苯丙氨酸27殘基/1000殘基、脯氨酸101殘基/1000殘基、絲氨酸143殘基/1000殘基、蘇氨酸78殘基/1000殘基、纈氨酸53殘基/1000殘基。

6.如權(quán)利要求l?至5任一所述的貽貝糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而得到：

（1）勻漿：新鮮貽貝洗凈、去殼，軟組織勻漿2～4?min，按1g:10～15mL比例加入Tris-HCl緩沖液（pH?6.8，0.05?mol/L），0～4℃攪拌提取36～48?h，于10000～12000?r/min、0～4℃離心10～20?min，收集上清液、濃縮，用15～20倍蒸餾水透析36～48?h（蒸餾水每12?h更換一次），冷凍干燥，得粗糖蛋白；

（2）陰離子交換層析：粗糖蛋白用Tris-HCl緩沖液（pH6.8，0.05?mol/L）配成濃度30～50mg/mL溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，加入到陰離子交換樹脂柱（1.6?cm×80?cm)，依次用含0、0.3和0.5?mol/L?NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，用考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15～20倍蒸餾水透析36～48?h（蒸餾水每12?h更換一次），冷凍干燥，檢測(cè)其細(xì)胞毒活性，活性最強(qiáng)組分為離子交換糖蛋白；

（3）凝膠柱層析：將離子交換糖蛋白用Tris-HCl緩沖液（pH?6.8，0.05?mol/L）配成濃度20～30mg/mL溶液，經(jīng)0.45?μm微孔濾膜過(guò)濾，加入到凝膠色譜柱（1.0?cm×30?cm)，用Tris-HCl緩沖液（pH?6.8，0.05?mol/L）洗脫，考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15～20倍蒸餾水透析36～48?h（蒸餾水每12?h更換一次），冷凍干燥，檢測(cè)其細(xì)胞毒活性，活性最強(qiáng)組分為凝膠層析糖蛋白；

（4）精制：將凝膠層析糖蛋白用Tris-HCl緩沖液（pH6.8，0.05?mol/L）配成濃度10～15mg/mL溶液，經(jīng)0.45?μm微孔濾膜過(guò)濾，利用蛋白快速純化系統(tǒng)（AKTA?purifier?100）制備，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟（1）中的貽貝為厚殼貽貝（Mytilus?coruscus）；所述的步驟（2）中的陰離子交換樹脂為DEAE?Sepharose?F?F；所述的步驟（3）中的凝膠為Sepharose?4B；所述的步驟（4）中的蛋白快速純化系統(tǒng)（AKTA?purifier?100）的條件為：色譜柱SuperdexTM?75制備柱，洗脫劑為雙蒸水，進(jìn)樣量20?μL，流速0.5?mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280?nm。

8.如權(quán)利要求1至5任一所述的貽貝糖蛋白在抗腫瘤藥物，特別是在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用。