[發明專利]一組抗腫瘤T淋巴細胞群及其制備方法

在審

• 申請號: 201410232783.6
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN103981146A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 蔣宇揚;陳妍
• 申請（專利權）人: 深圳市坤健創新藥物研究院;清華大學深圳研究生院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/14;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司 44101
• 代理人: 孫皓;陳貞

技術領域

本發明涉及一組抗腫瘤T淋巴細胞群及其制備方法。

背景技術

近年來腫瘤的免疫治療越來越受到重視。目前腫瘤的免疫療法主要包括腫瘤疫苗、單克隆抗體技術、細胞因子治療、過繼性細胞免疫治療等。其中過繼性細胞免疫治療是指向腫瘤患者傳輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤或激發機體抗腫瘤免疫效應，從而達到治療腫瘤的目的。主要的過繼性細胞包括淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、CD3單克隆抗體激活的殺傷細胞(anti-CD3MeAbactivatedkiller?cells)等。值得注意的是γδT細胞在過繼免疫治療中的潛在作用。γδT細胞是介于獲得性免疫與天然免疫之間的特殊免疫細胞類型，具有抗原特異性識別功能而無MHC限制，可在IL-2刺激下擴增，并在體外呈現出殺傷多種腫瘤的功能。以γδT細胞為基礎的免疫治療在肺癌、腎癌、惡性黑色素瘤等Ⅰ期臨床研究中已顯示出良好效果，尤其是轉移性惡性黑色素瘤，提示其可能成為治療腫瘤的新途徑。CD8+T細胞(TC或CTL細胞)能殺傷表達抗原的靶細胞，它在抗病毒感染、急性同種異型移植物排斥以及殺傷腫瘤細胞作用中是重要的效應細胞。在正常機體中CD8+T細胞以不活化的靜息T細胞的形式存在。它必須經過抗原激活并在T輔助(TH)細胞協同作用下，才能分化發育為效應殺傷T細胞(TC)。臨床病例報告CD8+T對不同類型的腫瘤具有不同的作用。目前，尚無報導具有抗腫瘤作用的混合的淋巴細胞群。

發明內容

本發明提供了抑制乳腺癌和肝癌細胞株的增殖、誘導癌細胞凋亡且抑制肝癌乳腺癌荷瘤小鼠體內腫瘤的生長的一組抗腫瘤T淋巴細胞群，本發明還提供了所述一組抗腫瘤T淋巴細胞群的制備方法。

本發明提供了一組抗腫瘤T淋巴細胞群，其包括表達人白細胞分化抗原CD3的細胞占71.63％～86.32％，表達人白細胞分化抗原CD4的細胞占16.43％～27.37％，表達人白細胞分化抗原CD8的細胞占65.58％～76.86％，表達人αβT細胞受體的細胞占11.90％～17.51％，表達人γδT細胞受體的細胞69.95％～83.74％。

本發明還提供了上述一組抗腫瘤T淋巴細胞群的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：取去白細胞濾器，過濾全血后，白細胞殘留在濾器中；

步驟二：使用磷酸緩沖液沖洗去白細胞濾器，獲得PBS、白細胞和部分血液的混合液；

步驟三：將磷酸緩沖液、白細胞和部分血液的混合液離心棄去血漿；

步驟四：向棄去血漿的細胞混合液中加入磷酸緩沖液，小心混勻形成混合液；

步驟五：將混合液小心疊加于細胞分離液上離心，此時離心管中由上向下分為四層：第一層為血漿層；第二層為環狀乳白色單個核細胞層；第三層為透明分離液層；第四層為紅細胞層；收集第二層細胞放入含磷酸緩沖液的試管中，充分混勻后，離心，棄去上清留沉淀,然后重復洗滌,最后沉淀得到所分離的外周血單個核細胞；

步驟六：將所分離的外周血單個核細胞培養于37℃，5％CO₂培養箱，用抗腫瘤T淋巴細胞群專用培養基過夜培養后，收集懸浮的淋巴細胞；

步驟七：每2-3天在該抗腫瘤T淋巴細胞群專用培養基中傳代一次，使細胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個細胞/mL，每次傳代培養的條件均為37℃，5％CO₂，傳5代以上，每代的培養條件相同，得到抗腫瘤T淋巴細胞群；

其中，所述抗腫瘤T淋巴細胞群專用培養基為是在無血清淋巴細胞培養基中添加異戊烯焦磷酸和人白細胞介素-2得到的培養基。

所述磷酸緩沖液為含有135mM?NaCl、4.7mM?KCl、10mM?Na₂HPO₄、2mM?NaH₂PO₄且pH值為7.4的水溶液。

所述步驟一中去白細胞濾器的規格為2單位400ml，全血為400ml，所述步驟二中的磷酸緩沖液為40-80ml。

所述步驟三中的離心速率為1500-2500轉/分，離心時間為15-20分鐘。

所述步驟四中加入的磷酸緩沖液為25-40ml。

所述步驟五中的細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司，產品編號為LTS1077，細胞液和細胞分離液的體積比為1.5:1-2:1，混合后離心的速率為2000-2500轉/分，離心時間為15-20分鐘。